富油底栖硅藻的筛选和培养条件的优化-水产养殖专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学 博/硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 施志仪 上海海洋大学 教授 主席 李家乐 上海海洋大学 教授 委员 沈和定 上海海洋大学 教授 委员 杨金龙 上海海洋大学 教授 委员 委员 委员 委员 牛东红 上海海洋大学 讲师 秘书 答辩地点 水产与生命学院 B102 答辩日期 2013.05．26 II 富油底栖硅藻的筛选和培养条件的优化 摘 要 本文以挂板法采集温州市洞头海区野生底栖硅藻，分离出 16 株底 栖硅藻，经培养后对藻细胞进行尼罗红染色观察，初步筛选出 9 株油 球较大的藻株，然后进一步开展培养和油脂测定实验，最终筛选出两 株生长较快、含油量较高的底栖硅藻——咖啡双眉藻 Amphora coffeaeformis 和缢缩菱形藻 Nitzschia constricta。以该两株底栖硅藻为对象， 探讨了尼罗红染色法检测硅藻油脂相对含量的最优条件和氮、磷、硅、 植物激素吲哚乙酸 IAA 和脱落酸 ABA、固定化对其繁殖生长和油脂积累 的影响。主要研究结果如下： 1.富油底栖硅藻的分离纯化和筛选 采用挂板法获得野生底栖硅藻，平板分离法和水滴分离法相结合分 离纯化得 16 株底栖硅藻，其中菱形藻属 5 种、双眉藻属 3 种、舟形藻 属 3 种、羽纹藻属 2 种、曲壳藻属 2 种、拟菱形藻属 1 种。硅藻细胞 经尼罗红染色荧光显微镜观察，初步筛选得 9 种油体占藻细胞体积较 大的藻株，其中菱形藻属 3 种、双眉藻属 3 种、舟形藻属 2 种、羽纹 藻属 1 种。根据 9 株微藻的比平均生长速率和总脂含量的乘积，最终 筛选出 2 株生长快、含油量高的底栖硅藻——咖啡双眉藻 Amphora III coffeaeformis 和缢缩菱形藻 Nitzschia constricta 作为实验藻株。 2.硅藻细胞尼罗红染色的条件优化 尼罗红（Nile Red）是一种脂溶性的荧光染料，细胞经尼罗红染色 后，在荧光显微镜下可观察到金黄色荧光。尼罗红染色荧光检测微藻 中油脂的相对含量的方法，其最佳条件因仪器和藻种差异会有所不同， 选择合适的染色条件对更准确快捷测定微藻油脂相对含量十分重要。 为优化两株藻株的尼罗红荧光光谱法测定油脂含量的最适条件，本试 验通过对两种藻株中性脂发射峰、尼罗红浓度、染色时间、细胞密度 的探索，得出了本实验对象两株藻株的尼罗红荧光光谱法测定油脂的 最适条件为：中性脂发射峰 575nm、尼罗红浓度 1μg/ml、染色时间 6min、 细胞密度 OD680＜0.5。 3.氮、磷、硅对两株底栖硅藻繁殖生长及油脂含量的影响 采用光密度法和尼罗红染色法分别测定了氮、磷、硅对底栖硅藻咖 啡双眉藻 Amphora coffeaeformis 和缢缩菱形藻 Nitzschia constricta 的繁 殖速度和油脂积累的影响。结果显示：2 种底栖藻在 NO3-N 浓度为 1.746 mg/L 时，细胞均无明显繁殖生长，且在实验第 7 天开始死亡，当 NO3-N 浓度继续升高后，细胞繁殖速度开始加快，当 NO3-N 浓度达 8.820 mg/L 后，硅藻细胞的繁殖速度不再明显加快。 在实验设置的浓度范围内，2 种硅藻的繁殖速度均随 H2PO4-P 浓度 升高而加快，但当 H2PO4-P 浓度达到 0.884 mg/L 后，硅藻细胞的繁殖 速度不再明显加快； IV 在实验设置的浓度范围内，2 种底栖硅藻均随 SiO3-Si 浓度增加而加 快，但 SiO3-Si 浓度对 2 种底栖硅藻细胞繁殖速度影响并不显著。 3 种元素对 2 种底栖硅藻繁殖速度的影响力：N＞P＞Si。实验期间， 2 种底栖硅藻的油脂含量均呈先降后升的变化规律，油脂的积累主要集 中在实验后期，氮磷硅限制均能促进 2 种底栖硅藻细胞油脂的积累， 对 2 株底栖硅藻细胞油脂积累的影响程度，氮限制比磷和硅限制都要 大。 4.植物激素 IAA 和 ABA 对两株底栖硅藻生长及油脂含量的影响 为探索植物生长激素对底栖硅藻繁殖生长和油脂积累的影响，作 者以咖啡双眉藻和缢缩菱形藻为材料设计了不同浓度 IAA 和 ABA 对 两种底栖硅藻繁殖生长和油脂积累影响的培养实验。结果表明：低浓 度的 IAA 和 ABA 能够明显促进两株藻的生长，高浓度则会抑制生长， 两株微藻最适宜 IAA 和 ABA 浓度有所不同：低浓度的 IAA 对两株底 栖硅藻的生长能起到明显的促进作用，0.5mg/L 时效果最为明显；IAA 浓度为 2 mg/L 组的细胞密度反而低于对照组的细胞密度；在对数生长 期向培养基中添加低浓度（0-1.0 mg/L）的 ABA 能够有效促进两株底 栖硅藻的生长，而高浓度（＞1.0