地衣芽孢杆菌抑真菌作用及相关基因的研究-微生物学专业论文.docxVIP

南开大学硕士研究生学位论文 南开大学硕士研究生学位论文 摘要 摘 要 本文介绍了利用Mu转座重组技术对本课题组分离的、能抑制病原真菌生长 的遗衣芽孢杆菌NKYM3菌株进行的掷真菌作用及祖关基因的研究，特另q探讨了 Mu转座复合物电转化地衣芽孢杆菌的最佳条件，为地衣芽孢杆菌抑真菌物质相 关基因的组织结构、生物功能和基因调控的研究奠定基础。Mu转座复合物是由 人工Mu转座子(携带一个卡那霉素抗性基因)，在体外与四聚体MuA转座酶形 成，然后，电转化地衣芽孢杆菌的受体细胞，引起插入位点基因的失活和相应表 型的改变，经重组抗性和表型筛选，可以进一步探索未知的地衣芽孢杆菌抑真菌 物质相关基因。 本研究建立了完整的地衣芽孢杆菌抑真菌的检测方法，确立了指示真菌，用 蛋白酶K消化地衣芽孢杆菌上清液，证明了抑真菌物质中含有蛋白质。探讨了 培养基中添加甘氨酸浓度、细胞的生长状态、电击电压、，质粒的质量浓度对地 衣芽孢卡f菌电转化效率的影响，优化了地衣芽孢杆菌的最适电转化条件：用含 O．34％甘氨酸的M9．YE液体培养基于37(2培养细胞至对数早期(OD600=0．5左 右)，制备浓度为10儿个细胞／毫升的感受态细胞，电击电压为1．Sky，涂布于含 0．25M蔗糖、50峙／IIll卡那霉素的固体M9．YE培养基上，得到6,8X105CFU／09 DNA(带有卡那霉素抗性标记的pNL501质粒)的高转化效率，并在国际上首次 成功的将Mu转座复合物电转化入地衣芽孢秆菌中，用1弘1 l：8稀释的转座复 合物与50眦感受态细胞混匀，电击电压为1．Sky，得到的转化效率为3× 102CFU／Og DNA。这为我们迸一步研究地衣芽孢杆菌的抑真菌物质相关基因奠定 了基础。 对抑真菌效果增强的Mu转座复合物转化子03001进行基因克隆和DNA序 列分析，得到编码地衣芽孢杆菌NKYM3菌株核糖体蛋白L33的rpmG基因，该 基因是地衣芽孢杆菌NKYM3菌株抑真菌物质分泌及芽孢形成的相关基因。这不 仅为我们进一步研究地衣芽孢杆菌的功能基因组奠定了基础，同时，也为其他革 兰氏阳性细菌的功能基因组研究开拓了新路。 关键词：地衣芽孢杆菌抑真菌Mu转座复合物电转化rpmG基因 南开大学硕士研究生学位论文 南开大学硕士研究生学位论文 摘要 Abstract To explore cluster of genes related to anti-pathogenic fungi in genomes of Bacillus licheniformis NKYM3 strain，all efficient insertional mutagensis strategy with Mu transposition complexes was applied．Mu transposition complexes assembled in vitro using artificial Kan-Mu transposon and foBImolecules of MuA transposases，then electroporated into B．1icheniformis NKYM3 strains isolated in lab．The trallsformants with resistance to kanamycin and phenotype against pathogenic fungal strains were screened to further functional genomic analysis．To detect the antifungal substance，the method and the tipical pathogenic fungi strain WaS determined，and protein Was proved in the antifungal substance with proteolytic enzymeK treatment。To optimize the condition of eleetroporation serial parameters including Glycine concentration in M9-YE medium，growth state of the strai／1 electroshock volage and plasmid concentration were studied。The cell culture grown in M9一YE medium containing 0．34％Glycine 37*(2 Was harvested at ODeo=0．5． washed