以lov2结构域为基础的荧光探针的设计对及胆绿素与dna相互作中用的研究.docx

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．3．6融合蛋白的亲和纯化及SDS．PAGE 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．3．6融合蛋白的亲和纯化及SDS．PAGE 24 2．3．7融合蛋白的荧光和紫外可见光吸收光谱的测定 26 2．4结果与分析 ．26 2．4．1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 26 2．4．2重组质粒的双酶切反应检测 27 2．4．3融合蛋白的SDS．PAGE 28 2．4．4融合蛋白的紫外吸收光谱和荧光光谱分析 30 2．5小结与结论 ．33 第三章以LOV2为基础的蛋白探针检测H92+ ．35 3．1前言 ．35 3．2实验材料 ．35 3．2．1菌株和载体 35 3．2．2培养基 36 3．2．3所用试剂 36 3．2．4实验仪器 36 3．3实验方法 ．36 3．3．1引物设计与PCR扩增 ．36 3．3．2 PCR产物的检测与胶回收 38 3．3．3重组质粒的构建 38 3．3．4重组质粒在原核生物E．coli中表达 39 3．3．5融合蛋白的亲和层析纯化及SDS．PAGE 39 3．3．6融合蛋白的荧光和紫外可见光吸收光谱的测定 39 3．4结果与分析 ．39 3．4．1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 39 3．4．2融合蛋白的SDS．PAGE 40 3．4．3突变融合蛋白与H92+的荧光光谱 ．．42 3．5小结与讨论 一44 第四章胆绿素与DNA相互作用的研究 46 4．1前言 46 II 万方数据 以LOV2结构域为基础的荧光探针的设计及胆绿素与DNA相互作用的研究4．2实验材料 以LOV2结构域为基础的荧光探针的设计及胆绿素与DNA相互作用的研究 4．2实验材料 ．46 4．2．1所用试剂配制 ．．46 4．2．2实验仪器 一47 4．2．3订购的DNA序列 47 4．3实验方法 ．47 4．3．1测定DNA与BV在pH=5．0．9．0的条件下的紫外吸收光谱 47 4．3．2 DNA与BV在pH=5．0、6．0、7．0的条件下的饱和度吸收光谱 ．48 4．3．3 DNA与BV在pH=5．0、6．0、7．0的条件下的化学计量数吸收光谱 ．48 4．3．4 BV对不同结构DNA在pH=5．0、6．0、7．0的条件下的选择性吸收光谱．48 4．4结果与分析 ．48 4．4．1 DNA与BV在pH=5．0．9．0的条件下的紫外吸收光谱 ．48 4．4．2 DNA与BV在pH=5．0、6．0、7．0的条件下的饱和度曲线 ．50 4．4．3 DNA与BV在pH=5．0、6．0、7．0的条件下的Job plot曲线 ．．52 4．4．4 BV对不同结构DNA在pH=5．0、6．0、7．0的条件下选择性吸收光谱 ．55 4．5小结与讨论 ．．58 参考文献 59 致谢 ．65 III 万方数据 以LOV2结构域为基础的荧光探针的设计及胆绿素与DNA相互作用的研究摘 以LOV2结构域为基础的荧光探针的设计及胆绿素与DNA相互作用的研究 摘 要 燕麦向光素的LOV(Light，Oxygen，Voltage)结构域包含LOVl和LOV2两个 亚基。其中LOV2结构域作为荧光蛋白，相比于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，具有自身独特的优点：1、LOV2结构域蛋白是可溶性的；2、它的 相对分子质量小，大约只有100．140个氨基酸残基；3、它的光吸收辅助因子一黄素 单核甘酸(flavin mononucleotide，FMN)几乎存在于所有类型的细胞中；4、相同条 件下，其荧光强度显著强于绿色荧光蛋白。正是由于这些优点使其成为了光遗传学 研究的理想工具，广泛地被应用于医学和生命科学的研究中。 本论文主要包括以下三个部分的工作： 1．本研究根据Genebank中的燕麦向光素基因序列，人工合成了LOV2结构域编 码的基因片段：AsLOV2(404．560)；并构建C450A突变基因，AsLOV2(404．560， C450A)：进一步缺失C末端的J0【肽段，得到AsLOV2(404．521，C450A)。这三 个基因片段被克隆于表达载体pGEX-6p-1，利用亲和层析的方法，纯化得到与gst 标签融合的目标蛋白。结果表明三种纯化蛋白具有与参考文献一致的吸收光谱，且 三种蛋白均可与FMN结合，并表现出光活性。在荧光强度方面，突变蛋白的荧光 强度大约是野生型的6倍，突变截短型蛋白的荧光强度大约是野生型的7倍。在此 前提下，本研究还构建表达了AsLOV2(404．521，C450A)与细胞色素b562 (cytochrome b562，cytb562)的融合蛋白，即cytb562-