日本血吸虫非典型蛋白激酶rio2功能研究-预防兽医学专业论文.pdf.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．2．18盐酸卡红染色及共聚焦观察 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．2．18盐酸卡红染色及共聚焦观察 ．．23 3．2．1 9虫卵计数 ．．23 3．2．20黜02截短蛋白的原核表达 24 3．2．21 BCA法测蛋白浓度 24 3．2．22蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 25 3．2．23日本血吸虫m02蛋白多克隆抗体IgY的制备 25 3．2．24 ELISA测定多抗血清效价 26 3．2．25日本血吸虫组织蛋白提取 。26 ：；．2．26 Western-Blot ．．27 4结果与分析 ．．28 4．1日本血吸虫砒02和Pn【1基因的双链RNA制备 ．．28 4．1．1日本血吸虫总RNA提取 ．28 4．1．2从日本血吸虫cDNA中扩增m02和Pn【1基因模板 29 4．1．3获得pMD 19．T-Ri02和pMD 19．T-PIkl质粒模板 30 4．1．4单酶切获得带有启动子的线性DNA模板 ．3 1 4．1．5体外转录获得双链I斟A ．．32 4．2日本血吸虫Ri02和Pll【1基因的体外RNA干扰实验荧光定量结果 一33 4．3 RNA干扰实验表型分析 一35 4．3．1干扰后血吸虫体长测量结果 35 4．3．2干扰后血吸虫虫卵计数结果 36 4．3．3干扰后E(1U检测细胞有丝分裂增殖情况 ．．36 4．3．4干扰后共聚焦显微镜观测表型 41 4．4融02卵黄抗体IgY的制备 45 4．5抗日本血吸虫截短蛋白m02卵黄抗体的免疫反应性检测 ．．46 4．5．1血吸虫组织总蛋白的提取 46 4．5．2原核表达蛋白及日本血吸虫天然蛋白的Western blot 。47 5讨论 。48 5．1 RNA干扰及表型分析 。48 5．2本课题未能获得显著的m02干扰表型的原因 ．．51 6结论 ．．52 附录 ．63 致谢 ．64 II 万方数据 日本血吸虫非典型蛋白激酶R102功能研究摘要 日本血吸虫非典型蛋白激酶R102功能研究 摘要 血吸虫是一种雌雄异体的吸虫纲裂体吸虫，能够感染多种哺乳动物，引发影 响全球近两亿三千万人口的严重寄生虫病。在我国主要流行的是日本血吸虫病， 主要的治疗药物为吡喹酮。由于缺乏有效的疫苗及受到可能出现耐药性的威胁， 目前对于血吸虫的研究还任重道远。 蛋白激酶能够磷酸化蛋白底物使其构象或活性发生改变，调控生物体内多个 细胞进程，可作为良好的药物设计靶标。蛋白激酶可以分为真核蛋白激酶(ePICs) 和非典型蛋白激酶(aPKs)，其中非典型蛋白激酶不具有保守催化结构域，但具 有激酶活性。Rio激酶是非典型蛋白激酶13个家族成员之一，在从古菌到人类的 几乎所有物种中保守存在，RIO激酶家族有Riol，Ri02，耻03和硒oB四个成员。 在对酿酒酵母的研究中发现RIO激酶参与了核糖体前体的组装以及细胞周期进 程，其中Ri02对于18S rRNA的合成和有丝分裂中后期转化至关重要。而在寄生 虫领域，特别是血吸虫中，还尚未有文献报道RIO激酶的功能。因此，本课题在 实验室建立的分子基础上对Ri02的功能进行了研究。 1) 日本血吸虫鼬02和Plkl的体外RNA干扰实验 由于Ri02为Polo．1ike激酶Plkl的磷酸化底物，因此使用双链RNA进行了分别 干扰m02，Plkl和同时干扰这两个基因的体外RNA干扰实验。28天收集的成虫体 外干扰9天后，经荧光定量PCR检测获得了对两个基因75％．95％的良好干扰效率。 2)对干扰后的表型进行观察 对干扰期间的雌虫产卵数进行计数，发现在3．5天、5．7天、7-9天三个阶段各 干扰组与对照组均未产生显著性差异；干扰后测量雌雄虫的体长，各干扰组与对 照组均未产生显著性差异，说明干扰对血吸虫的产卵过程和生长发育没有显著影 响。 在干扰培养中加入EdU标记虫体中正在有丝分裂的细胞，收集样本后在共聚 焦显微镜下观察：干扰Plkl后显著抑制了雌雄虫的生殖器官中细胞的有丝分裂， 干扰Ri02只轻微抑制了有丝分裂过程，而双干扰与Plkl单干扰的结果类似。说明 IU02对于有丝分裂过程影响不如Plkl显著。 使用盐酸卡红染色干扰后的虫体，在共聚焦显微镜下观察形态：干扰Plkl后 卵巢和卵黄腺中的细胞数目有所减少，而干扰Ri02后卵黄管中细胞数目增多，雌 虫子宫中虫卵增多，双干扰后虫体的表型接近对照组，说明Plkl和Ri02可能起到 了相反的功能。 3)荧光定量PCR检测干扰后对雌虫中凋亡相关基因的影响 在干扰培养后收集雌虫提取RNA反转录为eDNA模板进行荧光定量实验，检 钡lJCaspase3，Caspase7和CIAPl=个凋亡相关基因的转录水平，结果发现在干扰 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生