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第四章 核酸的分离与纯化 第一节 基本概念 一、 核酸分离纯化的原则 1 保证核酸一级结构的完整性 2 去除其它生物大分子的污染（蛋白、糖类、脂类分子）。 3 去除其它核酸分子的污染（提取 DNA，去除 RNA 污染）。 4 去除对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子。 注意事项 1 简化操作步骤，缩短提取过程。 2 防止物理、化学因素（剪切力、高温、强酸强碱）对核酸的降解。 3 防止生物因素（核酸酶）对核酸的降解。 二、主要步骤和基本方法 破碎细胞→去除其它生物大分子→去除其它核酸分子 →除盐、有机溶剂→进一步纯化核酸 破碎细胞方法： 超声、匀浆、液氮(剧烈)；蛋白酶 K＋去污剂(温和) 除蛋白质方法： 酚、氯仿抽提(剪切力)；甲酰胺解聚 除其它核酸方法：选择性沉淀；酶解 除盐方法： 透析、凝胶过滤 核酸质量检测： OD260/OD280(纯度)；琼脂糖电泳、脉冲场电泳(大小) 第二节 真核细胞染色体 DNA 的制备 一、 生物样品的制备 1 生物组织 组织表面清理→液氮冷冻→粉碎组织块→DNA 提取液（含胰酶） DNA 提取液 2 培养的细胞 细胞悬液→离心收集细胞→PBS 洗细胞→DNA 提取液悬浮细胞 3 血液样品 新鲜血液→加 ACD 抗凝液混匀→0℃保存数天↖ －70℃冻储→解冻后 PBS 洗细胞 离心取下层白细胞→DNA 提取液悬浮细胞 二、 染色体 DNA 的提取 1 酚抽提法 悬浮于 DNA 提取液的细胞→蛋白酶 K 裂解细胞消化蛋白→酚抽提蛋白→离心→吸取上层粘稠水相→透析 →获得 200kb DNA ↘ NH4Ac 沉淀→玻棒捞出 DNA 纤维(100-150kb) 2 甲酰胺解聚法 酚抽提改为甲酰胺解聚，操作步骤少，所得 DNA200kb。 3 玻棒缠绕法 用盐酸胍一步裂解细胞，简单快速。所得 DNA 约 80kb,可用于 Southern blot，不适于构建文库。 4 少量组织 DNA 提取法 操作体积小，步骤相对简单。可用于果蝇、鼠尾、细胞等 DNA 的提取。DNA 纯度低，分子量小，只适于 Southern 杂交。 第三节 质粒与噬菌体 DNA 的提取与纯化 一、质粒的提取纯化 1 基本概念 质粒是一种双链闭合环状 DNA 分子，它原本存在于细菌胞体内部，是细菌内的共生型遗传因子。随着细 菌的扩增，质粒的拷贝数也增加。质粒是携带外源 DNA 进入细菌扩增表达的媒介物。 2 质粒的制备(培养细菌，扩增质粒) 挑单菌落→LB 培养→摇菌过夜→生长对数期菌→加氯霉素进行选择性生长 3 质粒的提取（裂解细菌，去除蛋白和细菌染色体 DNA） 菌液离心收集菌体→STE 漂洗菌体沉淀,去除代谢物→裂解细菌 细菌裂解法： (1) 煮沸法：溶菌酶消化细菌壁，煮沸使细菌染色体 DNA、蛋白质变性。简单、经济。不适于富含糖类菌 株(HB101、TG1)中质粒的提取，糖可抑制内切酶活性。不适于含有 endA+型菌株中质粒的提取，这类菌含 有核酸内切酶 A，煮沸不能使其失活。煮沸时间过长，质粒 DNA 不可逆变性，内切酶切割困难，EB 染色 效率低。 (2) 去污剂法： SDS 解聚蛋白与 DNA 的结合。细菌悬浮液含 10％蔗糖，提高溶液的渗透压，减轻细菌裂 解时 DNA 泄漏过快产生的机械剪切力以及后续操作中的机械剪切力。提取效率低。但温和，适于15kb 的 质粒的提取。 (3) 碱变性法： pH12～16 时，线性细菌染色体 DNA 变性，闭环质粒不变性。中和后，在高盐存在下，DNA 聚合成网状不溶物，在 SDS 作用下 DNA 与蛋白质形成沉淀，CC 质粒 DNA 仍为可溶物。 (4) 小量一步提取法：将裂解细菌和蛋白质变性一步完成，操作简单、快速（0.5 h 可完成）、经济。所提质 粒可用于酶切图谱分析。 细菌培养物＋酚/氯仿→离心→上清为质粒 DNA (5) 菌落裂解法：不摇菌、不酶切。适于阳性克隆鉴定。 (6) 魔力柱小量质粒 DNA 制备：碱裂解＋特殊树脂构成的柱层析 免去离心、沉淀 DNA 的步骤，省时（15可完成），质粒纯度高（可用于测序、体外转录实验） (7) 质粒的大量制备：与小量制备原理相同，方法相似。 注意：加氯霉素抑制菌体生长。两次接菌。 4 质粒 DNA 的纯化 不仅去除蛋白质、糖类、染色体 DNA、RNA 等杂质，还要使质粒构型单一。 (1) CsCl 密度梯度超离心法：纯化的质粒纯度高，可用于转基因动物、真核细胞转染、DNA 外切酶删切 缺失等实验 (2) 聚乙二醇沉淀法：经济简单，尤其对碱裂解提取的质粒的 DNA 的纯化效果好。所提的质粒可用于细 菌转化实验、酶切。 二、 噬菌体的提取 1 基