牛结核病胶乳凝集方法研究以与临床初步应用.pptVIP

硕士论文答辩 汇报内容 一、文献背景及研究目的意义 二、研究思路与策略 三、试验方法、结果与讨论 四、小结与展望 五、研究成果 一、文献背景及研究目的意义 文献背景 结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病。据WHO估计全球约有20亿人感染，每年新病例达800-1000 万，约300万人死亡。 牛结核病被国际兽医局（OIE）定为B类动物传染病。历来是严重威胁奶业健康发展的重大传染病。 除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会取得成功。 一、文献背景及研究目的意义文献背景 我国对奶牛结核执行检疫-捕杀政策； 灵敏快速特异的检测方法是有效执行该防疫政策的重要前提； 牛结核病的防制主要是采用牛提纯结核菌素进行变态反应检疫； 皮内变态反应的缺点:结核菌素成分复杂其特异性受其他分枝杆菌影响而造成假阳性； 反复检疫、结核病感染严重、体质低下、牛体内抗体水平较高等都可造成假阴性； 文献背景及研究目的意义研究目的意义 本论文旨在建立奶牛结核病抗体检测的有效方法 牛结核病乳胶凝集方法(LAT)； 以求将LAT、结核菌素皮内变态反应(TST)联合使用，避免TST对病程严重牛的漏检，建立更加科学、客观的根除策略。 三、试验方法、结果与讨论 克隆牛型结核分枝杆菌mpb70 表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70 建立牛结核病乳胶凝集抗体检测方法 临床样本检测 结果分析讨论 试验方法、结果与讨论　本论文中构建的重组载体 试验方法、结果与讨论克隆牛型结核分枝杆菌mpb70 试验方法、结果与讨论表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70 试验方法、结果与讨论　胶乳颗粒偶联蛋白模式图 建立乳胶凝集抗体检测方法　最佳偶联MPB70蛋白量的确定 　　 建立乳胶凝集抗体检测方法最佳偶联时间的选择 建立乳胶凝集抗体检测方法最佳胶乳浓度的确定 试验方法、结果与讨论乳胶凝集方法条件优化的结果 确立乳胶致敏MPB70的一系列最佳反应条件：乳胶最终浓度0.5%；EDC与乳胶最佳反应时间为3h； MPB70的最佳致敏量为0.1mg/ml乳胶； MPB70最佳反应时间为6h；以及一系列的缓冲液的离子浓度和pH值等。 建立乳胶凝集抗体检测方法偶联反应终止剂 抗原与乳胶微球过度偶联会导致抗原失活，从而降低抗原-微球基质与抗体结合的能力。所以需要在反应体系中引入其它氨基基团以终止偶联反应。常用的终止剂为乙醇胺和甘氨酸。经试验验证乙醇胺的终止效果要好于甘氨酸，故选用乙醇胺作为终止剂，所用的浓度0.1M，剂量为1mL浓度为1％的羧化乳胶中加入50μL，终止时间为15min。 建立乳胶凝集抗体检测方法封闭剂的选择 乳胶微球上未结合抗原的位点需要用封闭剂封闭以防止出现非特异性反应，但同时过度的封闭会降低乳胶试剂的敏感性。所以需要优化合适的封闭条件。在实验中，发现用BSA封闭后乳胶试剂的敏感性会有所降低，而当不用封闭剂封闭时，并没有出现非特异性反应，所以，制备乳胶试剂时不进行封闭。 建立乳胶凝集抗体检测方法LAT的特异性和敏感性试验 建立乳胶凝集抗体检测方法重复性试验 建立乳胶凝集抗体检测方法临床样本检测 对武汉市奶牛场A临床检测的70头奶牛中，TST、MPB70-LAT、IHA及Serum-ELISA的分别检出阳性牛44、32、34、42； 对武汉市奶牛场B临床检测的61头奶牛中，TST、MPB70-LAT、Milk-ELISA及Serum-ELISA的分别检出阳性牛44、47、52、42； 几种检测方法的检出率和符合率见下表： 建立乳胶凝集抗体检测方法武汉市Ａ牛场70份临床样本检测结果 建立乳胶凝集抗体检测方法武汉市B牛场61份临床样本检测结果 四、小结与展望 MPB70是一种牛分枝杆菌特异性分泌蛋白质，其分泌量占牛分枝杆菌培养基蛋白总量10%； MPB70在大肠杆菌中可以高效率的表达，且具有天然的热稳定性，为诊断方法的建立及诊断试剂的保存提供了有力条件； 以羧化的聚苯乙烯乳胶为载体，采用了共价偶联，双功能试剂，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。 五、小结与展望 通过临床检测结果，与国际金标准TST的比较，说明MPB70蛋白乳胶凝集方法符合特异快速敏感检测方法的标准。与皮内变态反应联合应用可以为我国的牛结核病检疫防控提供有效的工具。 基于以上临床试验和分析讨论，可见本方法的优点，有望开发成诊断试剂盒，在临床上广泛推广应用。本实验室已经递交了新兽药证书申请材料，临床试验已获审批，且正在进行。 研究成果 　　　　　在读期间发表文章 钦博，胡巧云，喻正军，晁彦杰，张桂荣等.牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用，中国预防兽医学报 胡巧云，钦博，张桂荣等.结