NY/T 544-2002猪流行性腹泻诊断技术.pdf

ICS11.220 B 41 中华 人 民共和 国农 业 行 业标 准 NY/T544-2002 猪流行性腹泻诊断技术 Diagnostictechniquesforporcineepidemicdiarrhoea 2002一08一27发布 2002一12一01实施 中华人 民共和 国农业部 发 布 355 NY/r544-2002 前 言 猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两 者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。 本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。 本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、终有恩。 NY/T544-2002 猪流行性腹泻诊断技术 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹 心酶联免疫吸附试验(ELISA),检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。 本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。 2 病毒分离与鉴定 2.1 材料准备 2.1.1 器材 倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。 2.1.2 培养基及溶液的配制 磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-经乙基呢嗓-N-2一乙烷磺酸(HEPES)液(配 制方法见附录A), 2.1.3 细胞 Vero细胞系。 2.2 病毒分离 22-1 病料采集 采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。 2.2.2 病料处理 将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000IU/mL青霉素,1000Wg/mL链霉素,PBS液制成5倍 悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22pm徽孔滤膜过滤，分装，一20℃保存 备用 2.2.3 接种及观察 将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Ver。细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37C 吸附Ih，根据组织堵养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d-4d，按致 细胞病变作用(CPE)变化情况，可盲传2代一3代。 2.3 结果判定 CPE变化的特点是:细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞((7个~8个甚至几十个〕，并可见空斑样小 区，细胞逐渐脱落，这是特征性的CPE，可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞 培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中 电镜观察可见到冠状病毒粒子。 3 直接荧光抗体法 3.1 材料准备 3.1.1 器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。 3.1.2 荧光抗体(FA), 3.1.3 溶液配制:磷酸盐缓冲液((PBS),0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油(配制方法见附录B) NY/r544-2002 3.2 操作方法 3.2.1 标本片的制备 3.2.1.1 组织标本 采急性期内((5d-7d)患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片((4pm-7pm)，丙酮中 固定10min，置PBS中浸泡10min-15min，风干或自然干燥。 3.2.1.2 细胞培养盖玻片 将分离毒细胞培养24h-48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次，放人丙酮中固定 10min，再置于PBS中浸泡10min-15min，风干。 3.2.2 FA染色 3.2.2.1