ucp2在脓毒症大鼠心肌细胞线粒体中的作用及初步机制探讨儿科学专业论文.docxVIP

博士学位论文用脂多糖及肽聚糖混合制剂刺激细胞，通过检测心肌细胞线粒体的形态，线粒 博士学位论文 用脂多糖及肽聚糖混合制剂刺激细胞，通过检测心肌细胞线粒体的形态，线粒 体肿胀度、线粒体膜电位、线粒体ROS及氧化应激指标、线粒体ATP含量、 线粒体mtDNA等指标，揭示UCP2在脓毒症心肌细胞线粒体中的保护作用及 机制，为临床治疗脓毒症时心肌损伤提供基础理论支持。 研究方法 1、实验分组 ①RNA干扰筛选实验分组：筛选有效的UCP2干扰基因片段。将H9C2心肌细 胞随机分成五组，分别为：@Control组，给予等量的生理盐水；(虿)Lipofectamine 组，给予等量的Lipofectamine 2000；@siRNAl组，给予siRNAl干扰序列； (至)siRNA2组，给予siRNA2干扰序列；(9ncRNA组，给予ncRNA序列。上述 各siRNA的终浓度为80 nmol／l。 ②干扰实验分组：将H9C2心肌细胞随机分成四组，分别为：@Control组，给 予生理盐水刺激；(堇)LPS／PepG组，给予LPS及PepG刺激；(国LPS／PepG+siRNA 组，给予LPS及PepG刺激后予siRNA干预；(至)LPS／PepG+ncRNA组，给予 LPS及PepG刺激后予ncRNA干预。上述LPS的终浓度为2 pg／ml，PepG的终 浓度为20 lag／ml。 ③过表达细胞分组：将H9C2心肌细胞随机分成四组，分别为：@Control组， 给予生理盐水刺激；(至)LPS／PepG组，给予LPS及PepG刺激；@PHBLV组， 空病毒载体转染H9C2细胞，然后给予LPS及PepG刺激；@PHBLV-UCP2组， 然后给予LPS及PepG刺激UCP2过表达H9C2细胞。上述LPS的终浓度为2 IJtg／ml，PepG的终浓度为20 I．tg／ml。 2、RNA干扰实验 ①结合文献及前期实验结果，按照RNA干扰片段设计方法，设计2条RNA干 扰片段，先进行预实验，确定有效的siRNA；然后以此siRNA作为干扰片段， 进行RNA干扰实验； ②将siRNA转染心肌细胞，然后观察其在脓毒症条件下，对线粒体形态及功能 ⅡI 万方数据 中文摘要的影响。 中文摘要 的影响。 3、UCP2过表达慢病毒载体的构建及稳定心肌细胞株的筛选 ①提取大鼠总的RNA，反转录得到cDNA，调取UCP2目的基因并进行PCR扩 增，电泳回收目的基因。pMDl9．T载体(克隆载体)与UCP2目的基因的连接， 然后转染新鲜的大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。②从UCP2重构 的T质粒中扩增目的基因， 然后与慢病毒穿梭载体 pHBLV-IRES．ZsGreen．PGK．puro进行连接；然后将连接产物进行转化及扩增、 并测序。③慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，共转染293T细胞，收 集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，过滤并超离心浓缩病毒，并进行浓度滴定。 ④慢病毒感染稳定细胞系，慢病毒感染心肌细胞后，用嘌呤霉素进行筛选，直 至筛选完全。因载体能合成抗筛选药物的蛋白而得以存活，以空载的细胞为阴 性对照实验。经PCR及WB验证，证实UCP2过表达H9C2细胞株建立成功， 可进行下一步实验。 4、脓毒症心肌细胞模型指标：CK及LDH，IL．6及TNF．a水平 ①比色法检测肌酸激酶：用多功能酶标仪，按照南京建成的检测肌酸激酶测试 盒说明书，进行操作。 ②比色法检测乳酸脱氢酶：用多功能酶标仪，按照南京建成的检测乳酸脱氢酶 (LDH)测试盒说明书进行操作。 ③ELISA法检测IL．6水平：根据试剂盒说明进行操作。试剂盒为：Rat Interleukin 6(IL一6)ELISA Kit，Cusabio Life Science，Wuhan，China。 ④ELISA法检测TNF．0【水平：根据试剂盒说明进行操作。试剂盒为：Rat TNF．0【 ELISA Kit，Cusabio Life Science，Wuhan，China。 5、线粒体形态分析：电镜观察线粒体形态学变化，流式细胞仪检测线粒体肿 胀度 ①电镜观察标本制备：培养并收集心肌细胞，先用3％戊二醇固定，再予1％饿 酸后固定，用酒精脱水，然后置换、包埋、浸透、包埋。电镜修块，在AO超 万方数据 博士学位论文薄切片机下切1州的半薄切片，饱和醋酸双氧铀染后电镜下观察。 博士学位论文 薄切片机下切1州的半薄切片，饱和醋酸双氧铀染后电镜下观察。 ②线粒体肿胀度检测：采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)常规的绿色荧光 (FITC．H)和红色荧光(PI．H)进行检测，以红色荧光强度／绿色荧光强度计算 膜电位，比值可间接反映线粒体膜电位变化。以前向角散射(forward sca