瑞氏木霉内切葡聚糖酶ⅱ蛋白质工程改造和表达研究微生物学专业论文.docxVIP

山东人学博L学位论文摘要 山东人学博L学位论文 摘要 纤维素酶已经被成功应用于纺织、造纸、食品、饲料工业，并且随着生物能 源工业的出现，其市场潜力越来越大。当纤维素酶被用于纺织、造纸等纤维加工 工业中时，往往需要接触一些偏碱性的环境。而大多真菌纤维素酶由于在高pH 下活力丧失严重，其应用受到诸多限制。许多研究者希望通过蛋白质工程的手段 改造纤维素酶并获得其最适pH和酶活力均有所上升的突变体酶。 酿酒酵母由于其转化和表达的高效性是一种良好的分子改造的宿主。许多来 源于真菌的纤维素酶已经被表达于酿酒酵母中，并获得了具有活性的重组酶蛋 白。内切葡聚糖酶II(EG II)是瑞氏木霉中最主要的内切酶之一，删除EG II的 瑞氏木霉其内切酶活性丧失了55％以上。在本实验室前期的工作中，从使用酿酒 酵母H158构建的瑞氏木霉cDNA文库中获得了内切葡聚糖酶II的基因e92，并 利用的定向进化方法筛选到一个最适pH有所提高的突变体。 通过进一步研究酿酒酵母中表达的重组内切葡聚糖酶II(rEG II)的酶学性 质和使用定向进化的手段提高其功能，可以进一步阐明酶的结构和其最适pH的 关系。这不仅可使瑞氏木霉内切葡聚糖酶更好的应用于偏碱性环境，也为研究蛋 白质的结构与功能的关系提供了有用的数据和信息。 本文的研究成果主要如下： 1．分析了糖基化对rEGII的影响 首先建立了表达于酿酒酵母H158的rEG II的分离纯化的方法，并进行了 SDS．PAGE后的活性染色：发现重组EG II具有能吸附于阳离子琼脂糖凝胶的C1 和不能吸附的C2两部分。C1部分是一个分子量57 KDa的蛋白，经内切糖苷酶 H(Endo H)酶解去除N糖基化后，其分子量下降为54 KDa，并保持大约88％ 的酶活力。C2部分是一个大分子量蛋白的集合体，经Endo H酶解后，其分子量 同样下降为54 KDa。重组Cl和C2部分对底物的降解能力和来源于瑞氏木霉本 身的native．EG II相似：C2部分具有对更高pH的适应性和更好的耐温性。 瑞氏木霉内切葡聚糖酶Il蛋白质工程改造和表达研究2．分析了rEG 瑞氏木霉内切葡聚糖酶Il蛋白质工程改造和表达研究 2．分析了rEG II第124位去N．糖基化后对重组酶性质的影响 使用重叠延伸的方法对rEG II的N．糖基化位点N124进行了定点突变，获得了 N124D和N124H的突变体。重组N124D和N124H的突变体酶同样具有C1和 C2两部分，其C1部分的分子量为54 KDa，和经Endo H处理过的野生型的C1 部分相同，显示去除N糖基化为其分子量的降低的原因。使用粗酶液测定了它 们的胞外CMCase活性、最适pH和对温度的适应性，未发现去除N．糖基化的突 变蛋白和野生型蛋白在以上酶学性质上有明显区别。 3．对rEG II的第342位位点进行了饱和突变和突变酶性质分析，探讨了此位点 在影响rEG II酶学性质上的作用 实现了对于来源于瑞氏木霉的内切葡聚糖酶II的第342位位点的饱和突变， 分析了此位点的突变对酶蛋白最适pH和酶活性的影响。将突变氨基酸分成3类， 发现带有脂肪侧链的氨基酸的突变，如突变体N342V，N342I，N342L均可以使 酶蛋白的最适pH向中性发生偏移。最大的偏移发生在N342R的突变体上，带来 了最适pH大约1．2的偏移，但其酶活力较野生型有大幅度下降。同属于碱性氨 基酸突变的N342K并未带来最适pH的改变。同源建模显示，N342位于EG II外 层Ct螺旋的C端。推测侧链的增大和H键的增多使螺旋更加的稳定，从而影响 了酶在高pH下的活力。 4．使用易错PCR和DNA重排的方法实现了对rEG II的定向进化，获得了几个 酶学性质有一定改良的突变体 使用定向进化(包括随机突变和DNA重排)的手段实现了对rEG II的改造。 纯化的突变体酶中，N39R／L218H／W276R／N342T的最适pH可以达到6．0—6．2， 在pH 6．2时催化效率较野生型提高了1．4倍。L218H和Q139RfN342T尽管其最 适pH变化不大，但其在pH 7．0时的催化效率较野生型提高了4倍。突变体结构 和功能的分析表明，更多稳定的螺旋和催化残基以及底物之间静电作用的改变是 突变体酶性质较野生型酶发生改变的原因。 山东人学博．f：学位论文5．对糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶信息学研究 山东人学博．f：学位论文 5．对糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶信息学研究 对糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶的氨基酸序列以及最适pH的数据进行 了收集，初步探究了氨基酸组成对纤维素内切酶最适pH的影响。研究了纤维素 内切酶中H+R、C+Y含量与最适pH的关系：发现随着H+R含量的上升，纤维 素内切酶的最适pH有所上升；随着C+Y含量的上升，