基因工程常用工具酶及应用.ppt

第四章 基因工程的工具酶 及其应用 第一节　 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。 在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。这种细菌内部的限制与修饰作用分别由核酸内切酶和甲基化酶完成，构成了类似免疫的防御系统。 解释 何谓内切酶 -o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o- 红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点 限制性核酸内切酶的分类 目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程； 特点：识别切割位点比较专一，只有切割作用。无甲基化修饰作用。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性核酸内切酶同时具有内切活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂，特异性差，不适用于基因工程。 一.限制性内切酶的命名 Hind Ⅲ H in d Ⅲ EcoRI E co R I 二. II型限制酶的识别特点 识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固定位置切割，识别顺序为回文结构。（Palindrome） 四.识别位点与切割方式 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256（4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识别位点。 稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中出现的几率很小，可称为稀切酶。 为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。 个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸序列，如Acc I既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC。 位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的核苷酸组成与酶切效率有关，比如Nae I在pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个位点可迅速被Nae I切割。第三个位点稍慢。而位于1285处的第四个识别序列，切割的效率只有其他位点的1/15。 同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。 同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连接，形成的位点称为“杂种位点”，该位点不能再被原来的两种酶切割。 同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同. 同裂酶: 又称异源同工酶，来源不同,但识别位点和切割位点相同. 切割位点也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和Xma I(C↓CCGGG) 五.限制性内切酶的反应条件 反应温度 一般为37oC 反应体积20μl DNA含量 0.5－1μg 酶含量 1－2u DNA纯度：OD260/280nm1.7 阳离子 Mg2+ 反应时间 1-1.5h pH7.5 限制性核酸内切酶的反应条件 各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分为三组 低盐组 0～50mmol/L NaCl 中盐组 50～100mmol/L NaCl 高盐组 100～150mmol/L NaCl 限制性核酸内切酶的星号活性 当酶切条件发生变化时，限制性核酸内切酶的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称作限制性核酸内切酶的星号活性。 例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割位点大大增加。 第二节 其他工具酶 一.DNA聚合酶 作用: 依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与 模版互补的新链。 1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶具有三种酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 5’→3’ DNA外切酶活性 2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段 该酶是用枯草