葡萄籽原花青素对阿尔茨海默病的作用及其机制的实验研究中药学专业论文.docxVIP

广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明： 广州中医药大学学位论文原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人 或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向 国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中 医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名砌论文导师签名 日期：．矽工年r月以／日 摘 摘 要 目的： 采用APP／PSl双转基因小鼠及AB25-35诱导PCI2细胞氧化损伤模型，通过建立体 内外阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)模型，分别从整体及细胞水平上共同探讨 葡萄籽原花青素对AD的作用及其可能的机制。 方法： 以APP／PSl双转基因小鼠为AD动物模型，从行为学、基因及蛋白表达水平共同 探讨葡萄籽原花青素对小鼠的影响。APP／PSl双转基因小鼠随机分为：APP／PSl双转 基因模型组，盐酸多奈哌齐组，葡萄籽原花青素低、高剂量组，并以同品系同龄 C57BL／6小鼠作为正常对照组。给药各组分别灌胃给予盐酸多奈哌齐和葡萄籽原花青 素药液，模型及对照组给予等量生理盐水。给药2个月后，用Morris水迷宫法检测小 鼠空间学习与记忆的能力；小鼠处死后剖取海马组织，分别采用HE和刚果红染色法 检测小鼠海马组织病理形态学和CAl区B淀粉样蛋白沉淀情况；分别采用Real time PCR和Western blot的方法测定小鼠海马组织PS．1 mRNA和APP、Tau蛋白的表达。 PCI2细胞培养与鉴定后，以Ap25-35诱导建立氧化损伤细胞模型。24小时后葡萄 籽原花青素以12．599／ml、25pg／ml、5099／ml和100 1ag／ml的浓度分别干预，并与正常 培养的细胞对照。24小时后用CCK一8法和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH) 试剂盒分别检测细胞活力及LDH漏出情况，采用流式细胞术法测定细胞凋亡率及其 线粒体跨膜电位。 结果： Morris水迷宫法结果表明，与模型组比较，葡萄籽原花青素能明显增强小鼠空 间学习记忆的能力，表现为明显缩短逃避潜伏期和上台前的路程，增加穿台次数、中 央活动区域路程比和时间比。HE染色结果显示，模型组小鼠的海马神经细胞排列松 散、紊乱，细胞结构不清，部分细胞空泡变性，大部分细胞胞体缩小，核固缩深染。 而高剂量的葡萄籽原花青素使小鼠海马的神经细胞排列整齐、紧密，各层细胞轮廓 清晰，未见固缩坏死及空泡变性。刚果红染色结果显示，模型组小鼠的大脑海马区见 多处橘红色斑块沉积，而葡萄籽原花青素给药组CAl区橘红色斑块沉积数量和面积 均明显减少。与模型组比较，RealtimePCR和Westemblot结果表明葡萄籽原花青素 高剂量能显著降低小鼠海马区PS一1 高剂量能显著降低小鼠海马区PS一1 mRNA、APP和Tau蛋白的表达。 PCI2细胞培养第3天呈集落状生长，集落立体感强，形成密集的细胞簇， 呈多角形、不规则形或梭形，具有典型的神经细胞特征。CCK一8法结果表明，与 模型组比较，葡萄籽原花青素各给药组可使光密度值(Optical density，OD)提高， 表明细胞活力均显著上升。LDH试剂盒检测法结果表明，与模型组比较，葡萄籽原 花青素各给药组可使OD值显著降低，表明细胞LDH漏出率均显著降低。流式细 胞术检测法结果表明，与模型组比较，葡萄籽原花青素给药组的细胞凋亡率显著降 低，存活率和线粒体跨膜电位均显著升高。 结论： 在AD的药效学实验中，与模型组比较，APP／PSl小鼠的逃避潜伏期和上台前的 路程明显缩短，穿台次数、中央活动区域路程比和时间比明显增加。以上结果提示， 本研究中APP／PSl双转基因小鼠模型成功，且葡萄籽原花青素可以提高小鼠学习记忆 能力、改善AD导致的学习及记忆能力下降的症状。 在机制研究实验中，与模型组比较，APP／PSl双转基因小鼠的海马细胞排列整齐、 紧密并橘红色斑块沉积数量及面积减少，且PS一1 mRNA、APP和Tau蛋白的表达均 下降；与对照组比较，氧化损伤细胞的活力与线粒体跨膜电位增加，LDH漏出率与 凋亡率下降。以上结果提示，葡萄籽原花青素可保护细胞发生氧化损伤，降低LDH 的漏出，提升线粒体跨膜电位，从而降低细胞凋亡率