高糖诱导内皮祖细胞凋亡的内质网应激途径及其在糖尿病冠脉病变中的作用内科学心血管病专业论文.docxVIP

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：羔：!；!垄!；童 日期： 坠窭：!：2 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 山东大学博士学位论文论文I 山东大学博士学位论文 论文I 中文摘要 糖尿病大鼠骨髓源性内皮祖细胞凋亡的内质网应激途径 博士研究生王海滨 博士生导师康维强教授 葛志明教授 研究背景 内皮祖细胞是1997年发现的在成人体内能分化为内皮细胞的前体细胞，存 在于骨髓及外周血中。内皮祖细胞主要参与内皮细胞修复即血管的再内皮化以及 参与血管新生，由此近年来内皮祖细胞在血管病变中的作用越来越受到重视。糖 尿病血管病变的重要发病机制是内皮细胞功能受损及凋亡。血管内皮层完整性遭 到破坏，炎性细胞浸润至内皮下层促进动脉粥样硬化的发生发展，因此内皮功能 受损被视为糖尿病血管病交的始动因素。正常状态下，受损的内皮由周边内皮及 循环中的内皮祖细胞分化为内皮来修复，保持内皮层的完整性，一旦内皮祖细胞 受损，内皮损害和修复之间的平衡被打破，内皮层的完整性遭到破坏，由此发生 动脉粥样病变，因此内皮祖细胞在糖尿病血管病变中具有重要作用。已有研究证 实糖尿病时循环内皮祖细胞数量和功能均受损害，而循环内皮祖细胞来源于骨 髓，由此我们推测糖尿病时骨髓内皮祖细胞可能也受损。我们已知内质网应激介 导的B细胞凋亡是糖尿病发病的重要机制，由此我们推测内质网应激可能介导内 皮祖细胞的凋亡参与糖尿病血管病变的发病。迄今尚无观察糖尿病对骨髓内皮祖 细胞的凋亡有无影响及其机制的研究，本研究的目的旨在： 目的 1．建立糖尿病大鼠模型。 2．研究大鼠骨髓内皮祖细胞体外分离、诱导、培养及鉴定的方法。 3．检测糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓内皮祖细胞凋亡率，明确糖尿病时骨髓内皮祖 细胞是否受损。 4．检测糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓内皮祖细胞内质网应激标志物GRP78及内质 网应激特异性凋亡因子--caspase．12活性，以了解内质网应激是否参与介导糖尿 山东大学博士学位论文病时骨髓内皮祖细胞的凋亡。 山东大学博士学位论文 病时骨髓内皮祖细胞的凋亡。 方法 1．糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠模型的制备 雄性Wistar大鼠27只，随机分为2组：对照组12只，DM组15只。标准 大鼠饲料喂养1周后，禁食12h，DM组大鼠给以腹腔内注射链脲佐菌素(STZ) 65mg／kg，对照组大鼠注射等量柠檬酸钠／柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠成模标准为： 连续2次空腹血糖≥16．7mmol／L。未达成模标准者剔除。DM组大鼠血糖升高后， 饲以高脂高糖饮食，对照组则给予标准饮食喂养。 2．大鼠骨髓源内皮祖细胞的培养、鉴定。 2．1大鼠骨髓内皮祖细胞的培养 大鼠拉颈处死后无菌状态下分离股骨胫骨，将骨髓细胞以无菌PBS液完全 冲洗至离心管，应用大鼠淋巴细胞分离液(LTS．1083)以密度梯度离心法(2 000 rpm，30 min)分离单个核细胞。洗涤后以含20％胎牛血清的M199培养液重悬， 接种于培养瓶中，37C、5％CO：条件下培养。细胞培养24 h(早期贴壁)后收集未 贴壁细胞离心后以选择性培养基(M199培养基加入20％胎牛血清，100 pg／mL 链霉素，100U／ml青霉素，40 ng／mL大鼠血管内皮生长因子(VEGF,Peprotech, USA)，2 ng／mL人成纤维细胞生长因子(FGF,Peprotech,USA)，10 ng／mL人表皮 细胞生长因子(EOF,Peprotech,USA)以及10U／mI，肝素)重悬计数，1 X 106／mL 转入包被0．1％明胶(Sigma,USA)的24孔板和培养瓶中二次贴壁，4天后换液， 培养至第7天鉴定。 2．2大鼠骨髓EPCs的鉴定 细胞在含DiI．ac．LDL(2．4 gg／mL)的培养液中37。C避光孵育lh，然后以2％ 的多聚甲醛固定10rain，PBS液漂洗后再加FITC-UEA-1(10 gg／mL)避光孵育1 h。 PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察，显示红色荧光的为ag．LDL阳性细胞，显示 绿色荧光的为UEA．1阳性细胞，显示双荧光阳性