肝糖原的提取、鉴定及定量.docVIP

肝糖原的提取、鉴定与定量 一、实验目的 1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 4. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 （1）肝糖原的提取 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 （2）肝糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，而葡萄糖具有还原性，实验可利用呈色反应和葡萄糖的还原性，从而判定肝组织中糖原的存在 呈色反应具体如下： CuSO4 + 2NaOH == Na2SO4 + Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2 + C6H12O6 == 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH == Cu2O↓(红色) + H2O Cu(OH)2 == CuO↓(黑色) + H2O （3）肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10～100μg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。 利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分而保留肝糖原。 三、材料与方法： （1） 实验材料 如下表所示 类别 材料 实验样品 鸡肝 实验试剂 95％乙醇 0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液 0.15mol/L NaCl溶液 12mol/L HCl：浓HCl原液（36%～38%）。 12.5mol/L(50％)NaOH 碘试剂：碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中（注：实验室已配好）。 班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7?5H2O）173g和无水碳酸钠（Na2C03）100g溶于蒸馏水800mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3％硫酸铜（CuSO4?5H2O）l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存（注：实验室已配好）。 5.35mol/L(30％)KOH溶液 标准葡萄糖液(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，加蒸馏水溶解至500 mL（注：实验室已配好）。 17mol/L(90％)H2SO4 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。（即配即用，实验室已配好） 仪器及器材 普通离心机，室温至100℃恒温水浴箱，722型分光光度计，托盘天平两个 剪刀，镊子，研钵，100mL容量瓶，白瓷反应板 试管架，10mL离心管（2支）（注：实验中用玻璃试管代替离心管），（15×100）mm试管（6支） 刻度吸量管（2mL×1，5 mL×2），1000μL微量可调取液器 （2）实验步骤 1．实验流程： 肝糖原的提取与鉴定 鸡肝约1.0 g，剪碎 ＋5%CCl3COOH 1 ml 研磨至乳状 ＋5%CCl3COOH 3 ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min） 沉淀（弃去） 上清（取2 ml） ＋3ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟 离心5分钟（4000 r / min） 上清（弃去） 沉淀 ＋蒸镏水1 ml 沸水浴2分钟，溶解沉淀 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml ＋浓HCl 5滴 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却 糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴 呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液 ＋班氏试剂4滴 混匀 沸水浴2分钟，观察变化 糖原的定量测定 鸡肝0.10 g ＋30%KOH 1.5ml 沸水浴15分钟 冷却，全部转入100 ml容量瓶中 加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液 糖原的测定 （2）实验步骤 1.糖原的提取与鉴定 称取肝脏：称取约1.0g鸡肝。? 肝匀浆准备：在研钵中将肝脏组织剪碎，加入5%三氯醋酸1ml，将肝组织研磨至糜状，再