人工锌指核酸酶的设计与表达纯化.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１２）：３６～４０ 人工锌指核酸酶的设计与表达纯化 １ １ １ １ ２ ３ ２ １ 蒋　泓 　曾　芳 　王克振 　梁沂梅 　李月琴 　张细权 　周天鸿 　唐冬生 （１佛山大学医学院　佛山　５２８０００　２暨南大学生命科学与技术学院　广州　５１０６３２） （３华南农业大学动物科学学院　广州　５１０６４２） 摘要　设计表达了４个锌指核酸酶，用于切断人基因组中的ｒＲＮＡ基因家族的内部转录间隔序 列，造成双链断裂，以此提高针对多位点基因打靶的效率，为后续基因打靶应用于基因治疗研究 奠定基础。首先，在人 ｒＲＮＡ基因家族ＩＴＳ１序列中找到２个合适的９ｂｐ长的序列（中间间隔６ ｂｐ）为锌指蛋白识别位点，根据识别位点序列每个位点分别设计２个三锌指蛋白。通过设计引物 进行重叠延伸ＰＣＲ得到全长编码锌指蛋白的ＤＮＡ，分别克隆到表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋），构建重组 ? ＴＭ 质粒ｐＥＴ２８ａＺＦＰ，转化大肠杆菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ （ＤＥ３），实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与 ? 纯化。同时，将限制性内切酶ＦｏｋＩ的切割结构域分别与４个锌指蛋白序列采用ＰＣＲ拼接后克隆 ＴＭ 到表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋），构建重组质粒ｐＥＴ２８ａＺＦＮ，转化到大肠杆菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ （ＤＥ３），实现带 ? ? 组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。 关键词　锌指核酸酶　设计　生物合成　表达　纯化　基因打靶　基因治疗 中图分类号　Ｑ８１６ ［３～５］ 　　目前基因打靶技术主要应用于基因功能的研究、 达９ｂｐ～１８ｂｐ的序列 。１９９６年 Ｋｉｍ等发现，将已 ［１］ 研制人类疾病的基因治疗和研制动物生物反应器 。 知的识别特异 ＤＮＡ序列的锌指结构与限制性内切酶 但是基因打靶技术存在打靶效率低、容易受到随机插 ＦｏｋＩ中无特异性识别作用的切割结构域通过一个 入的干扰等不足之处，这主要是由于目前基因打靶技 “ｌｉｎｋｅｒ”串联表达，可以组合成一个新的限制性内切 术的靶位点通常为单拷贝序列所造成的。ＤＮＡ重复序 酶———锌指嵌合核酸酶（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ），其 列被认为是外源基因整合的禁区，原因是重复序列处 识别和切割位点由其中的锌指结构决定。根据修复 通常无基因表达。然而前人研究表明，核仁组织区虽 ＤＮＡ双链断裂（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）的主要途径 以重复序列为主，但其中的基因完全能表达。因此，可 是同源重组；反之提高ＤＳＢ也能一定程度上提高同源 以利用细胞核仁组织区存在的非编码 ＤＮＡ重复序列 ［６～８］ 重组准确修复 ＤＳＢ损伤几率的原理 。因此，可以 ［２］ 作为靶位点，建立多位点基因打靶技术 。多位点基 使用人工设计合成的锌指嵌合核酸酶来进一步提高多 因打靶技术虽然有将基因打靶效率提高２００～３００倍、 位