mirnas在肝癌中的表达及临床意义临床检验诊断学专业论文.docxVIP

目 目 录 一、摘要 1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 3 二、正文 5 (一)一言(一) 5HtJ 舌 ”一 ”“ 一“ “一” ”‘ (二)材料与方法 0 0 6 1．实验材料 6 1．1 实验对象 6 1．2主要试剂 6 1．3 实验仪器 7 2．实验方法 7 2．1 细胞培养 7 2．2 临床标本的收集和保存 7 2．3 RNA提取和real．time PCR 8 2．4 RNA标记与芯片杂交 1 O 2．5 miRNAs沉默，过表达载体的构建 lO 2．6 Lipofectamine 2000转染 11 2．7 荧光素酶报告基因实验 11 2．8 RNA干扰 11 2．9过表达分析 11 万方数据 2．10 2．10 CCK．8检测细胞增殖活性 11 2．11 集落形成实验 1 2 2．1 2体外侵袭实验 1 2 2．13免疫印迹分析(Westem Blot analysis) 12 2．1 4肿瘤的异种移植模型 1 3 2．1 5组织化学染色分析 1 3 2．1 6计学分析 1 3 (三)结果 13 1．miRNAs在MHCC97．H与MHCC97．L细胞株中的差异表 达 ········· ·· ···········································l 3 2．1 3个miRNAs在细胞株及组织中的表达 1 5 3．miRNAs靶基因的预测及鉴定 1 6 4．miR-26a一2-3p，miR一5481和miR一34a-5p表达对肝癌细胞生物 学行为的影响 1 8 4．1上调miRNAs对肝癌细胞在体外的生物学行为的影响 18 4．2下调miRNAs对肝癌细胞在体外的生物学行为的影响 1 9 4．3 miRNAs对肝癌细胞在体内的生物学行为的影响 2l 5．ST3GAL5的表达调控对肝癌细胞生物学行为的影响 22 5．1上调ST3GAL5的表达增强肝癌细胞的迁移和侵袭 22 5．2下调ST3GAL5的表达抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力 23 (四)讨论 24 (五)结论 28 万方数据 (六)参考文献 (六)参考文献 29 三、综述 33 (一)综述 33 (二)参考文献 38 四、致谢 4 2 万方数据 大连医科大学硕士学位论文———————————_————————————————’————————_——_-———————●———————一_一一 大连医科大学硕士学位论文 ———————————_————————————————’————————_——_-———————●———————一_一一 miRNAs在肝癌中的表达及临床意义 硕士生姓名： 蔡红娇 指导教师：贾莉教授 专业名称：临床检验诊断学 摘要 目的：通过比较miRNAs在具有不同转移能力的肝癌细胞株MHCC97．H(高 转移)和MHCC97．L(低转移)中的表达差异，分析miRNAs与肝癌生物学特征的相 关性及其在肝癌中表达的临床意义，从而为进一步提高肝癌的诊断及治疗效果提 供新的策略及依据。 方法： (1)RNAs芯片技术对具有不同转移能力的细胞株MHCC97．H(高转移)和 MHCC97．L(低转移)中的miRNAs的表达情况进行分析，找出差异表达miRNAs， 应用qRT-PCR技术在人肝癌高低转移细胞株及肝癌和癌旁组织中验证基因芯片的 结果，初步探讨miRNAs在肝癌中的表达及临床意义。 (2)应用靶基因预测网站对差异表达的miRNAs的靶基因进行预测，根据预 测结果选取差异的miRNAs进行进一步的研究。 (3)分别上调和下调所选取的miRNAs的表达水平，利用体内、外实验检测 改变前后肝癌细胞的生物学行为，进一步探讨miRNAs在肝癌中表达的临床意义。 (4)干扰和过表达miRNAs的靶基因，改变其在肝癌细胞中的表达水平，体 内、外实验检测改变前后肝癌细胞的生物学行为，明确miRNAs影响肝癌转移的 机制。 结果： (1)有13个miRNAs在转移能力不同的肝癌细胞株中的表达存在差异，应用 qRT-PCR技术对肝癌及其相邻的癌旁组织中miRNAs的进行检测所得结果与在 细胞株检测的结果基本一致。 (2)基因预测网站预测miR．26a．2—3p，miR一5481和miR-34a一5p具有共同的靶 基因ST3GAL5，荧光素酶实验对预测结果进行了证实。 (3)上调miR．26a一2．3p，miR．5481和miR．34a．5p的表达水平能够降低 万方数据 大连医科大学硕士学位论文MHCC97．H细胞的增殖活性，集落形成数量，侵袭能力及体内成瘤性，下调 大连医科大学硕士学位论文 MHCC97．H细胞的增殖活性，集落形成数量，侵袭能力及体内成瘤性，下调 miR．26a