t2毒素及其主要代谢物ht2毒素在bewo细胞中的胎盘转运机制研究基础兽医学专业论文.docxVIP

T-2毒素及其主要代谢物HT-2毒素在BeWo细胞中的胎盘转运机制研究T-2毒素及其主要代谢物HT-2毒素胎盘转运机制研究 T-2毒素及其主要代谢物HT-2毒素在BeWo细胞中的胎盘转运机制研究 T-2毒素及其主要代谢物HT-2毒素胎盘转运机制研究 201 1届硕士研究生：王薇薇 导师：王玉莲副教授 (国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实 验室，华中农业大学中国武汉430070) 摘要 T-2毒素是镰刀菌属产生的一种A类单端孢霉烯族毒素，它是单端孢霉烯族毒 素中毒性最强的一种，广泛分布于自然界，是较常见的污染谷物与粮食的主要毒素。 大量体内研究表明，孕期经不同给药方式给予哺乳动物不同剂量的T-2毒素可引发 严重的母体毒性和胎仔毒性。对于T一2毒素的致畸毒性作用有学者认为是其对母体 的强烈毒性作用而间接导致的；但也有研究推测T-2毒素很可能通过胎盘屏障对胎 鼠产生直接的毒性作用。胎盘屏障是母体血与胎儿血在胎盘内进行物质交换所通过 的结构，是母体供给胎儿营养物质的唯一通道，但也是病毒、毒素、药物、激素等 进入胎儿的必经之路。至今尚没有定量的研究证实T-2毒素通过胎盘屏障进入胎儿 体内，并且其主要主要代谢物HT-2毒素是否也能通过胎盘屏障到达胎儿体内是未知 的，而进入胎儿的T-2毒素是否会通过胎盘发生逆向的交换也是值得关注的，因此 为了揭示T-2毒素在胎儿发育毒性和致畸毒性中所起到的作用，研究其在胎盘中的 转运机制是十分必要的。 本课题通过建立BeWo细胞模型模拟胎盘屏障，运用转运试验和摄取试验，考 察T-2毒素及HT-2毒素跨胎盘屏障转运的特征，从而阐明T-2毒素的胎盘转运机制， 为T-2毒素的发育毒性和致畸毒性提供合理解释。 通过BeWo细胞在Transwell系统中的生长特性考察，在本实验室条件下成功建 立了稳定可靠的胎盘转运细胞模型。通过三项质控标准判断模型的可靠性和稳定性， 在根本上保证了试验结果的可靠性和真实性。模型考察结果显示：BeWo细胞以2．24 ×105 cells／mL的密度接种于Transwell中，生长到第七天细胞跨膜电阻符合要求， 荧光黄通透率也符合模型的考察要求。 通过在Transwell模型中进行T-2毒素和HT-2毒素的跨细胞膜转运试验，考察 其双向转运特性。结果表明T-2毒素在两个方向上的转运具有显著的方向性，即吸 收方向的转运速率大于分泌方向；同时两个方向的转运都具有一定的浓度依赖性， 收方向的转运速率大于分泌方向；同时两个方向的转运都具有一定的浓度依赖性， 在高浓度也无法达到饱和。P．gp抑制剂剂维拉帕米、MRP抑制剂MK571以及BCRP 抑制剂K0143对I-2毒素两个方向上的转运均无显著影响。表明T-2毒素在外排方 向上的转运没有主动转运蛋白的参与，推测其主要外排机制为被动扩散。HT02毒素 的转运不具有不对称性的特点，其在吸收方向的转运速率与外排方向的转运速率非 常接近。并且也具有浓度依赖性，随浓度的升高，两个方向的转运速率都随比例升 高。P．gP、MRP、BCRP转运蛋白抑制剂均没有对其转运造成影响。表明HT-2转运 主要是以被动扩散的方式进行。 通过在标准细胞培养板中进行摄取试验考察这两种毒素的从母体．胎儿方向的 吸收特性，考察不同条件下BeWo细胞对这两种毒素的吸收情况来探讨他们的转运 蛋白的种类。试验结果表明T-2毒素在摄取方向具有饱和特性，证明载体蛋白的存 在。有机阴离子转运蛋白(OAT)抑制剂DIDS、PAH和Probencid对T-2毒素的摄 取都产生了显著性抑制作用，表明OAT转运蛋白超家族参与了T-2毒素在BeWo细 胞中的摄取；Cimetidine和TEA是有机阳离子转运蛋白(OCT)的抑制剂，在一定 程度上也抑制了T-2毒素的摄取，表明T-2毒素的摄取有一部分是由这类转运蛋白 介导。另外其Na+依赖性、质子梯度依赖性，同时其显著的pH依赖特性表明参与其 转运的可能为OATP．B转运蛋白家族。多种转运蛋白同时参与T-2毒素的摄取。而 HT-2的摄取不具有饱和特性，其摄取不具有Na+依赖性、质子梯度依赖性，OCT蛋 白抑制剂对其摄取不产生作用，而仅OAT蛋白抑制剂对其摄取有影响，表明其主要 从母体．胎儿方向的摄取方式为被动扩散。 本课题在体外系统中，首次定量证实了T-2毒素和HT-2毒素可以通过胎盘屏障 进入胎儿，T-2毒素在母体．胎儿方向转运显著高于从胎儿．母体，而HT-2毒素在两 方向上转运速率相当；并且首次研究了胎盘中表达的几种主要转运蛋白与这两种毒 素在胎盘中发生转运的关系，发现ABC外排转运蛋白在T-2毒素和HT02毒素从胎 儿．母体外排方向上的转运不参与介导作用，并且T-2毒素在母体．胎儿方向转运是一 个由载体介导的主动过程