第三章细胞工程基本技术.pptVIP

2 植物细胞工程实验室的设置 除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等。 细胞记数板和电子细胞记数仪 过滤除菌装置 离心机 移液管、吸管 离心管 移液器 天平 4 细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196℃） 四、培养用品的清洗 在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。 清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。 清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面三种： 强液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml 次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml 弱液：重铬酸钾l00g，浓硫酸l00ml，蒸馏水1000ml 配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸。 新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置。 也可以使用10％～40％的硝酸溶液。 3、塑料器皿的清洗 细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。 如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留附着物，用2％NaOH浸泡过夜，流水冲净后再用5％盐酸浸泡30min，自来水冲洗、蒸馏水漂洗2~3次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用。 五、消毒灭菌 防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。 　消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法。总的来说有物理方法和化学方法两大类。 物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。 化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 ３、湿热灭菌 湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。 各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般培养用液、橡胶制品要求10磅(114℃)，10～20分钟或8磅(112℃)30分钟。布类、玻璃制品、金属器械等为15磅(12l℃)20分钟。 。 ４、干热灭菌 　主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加温到160℃，保持1小时或更长时间，可达到消毒目的。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。 灼烧也属于干热消毒灭菌方法 ２、抗生素 　抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了预防。 最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等。常规培养用液抗生素浓度为：青霉素100单位／ml、链霉素100单位／m1、庆大霉素50μg／m1或l00μg／m1。 （二）污染对培养细胞的影响及检测 1、细菌的污染检测与控制 当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡。 采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。 用青霉素、链霉素可预防细菌的污染 2、真菌的污染检测与控制 常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。 可用抗真菌剂防止真菌污染。 3、支原体的污染检测与控制 支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测。 支原体的去除可采用：41?°C 4、病毒的污染检测与控制 病毒的污染主要是通过DNA的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。 对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及PCR法。 5、细胞交叉污染及检测 在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。 有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。 七、无菌操作技术（无菌操作的基本要领和要求） 在细胞培养中防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。为达到这一要求，所有工作要进行得有