p65低表达慢病毒诱导大鼠角膜移植免疫耐受的作用及机制眼科学专业论文.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 CD86、MHC等信号以及相应的抗原多肽。 NF．v,B蛋白是由Rel和NF．心两个家族成员共同构成的，一个是前体家族 包括NF．v,．B 1和NF．v,B2；另一个是Rel家族包括c．Rel、v．Rel、Rel．B和Rel．A (p65)。Rel／NF．KB家族的Rel同源结构域包括末端结构域、DNA结合结构域、 二聚体结构域和核定位序列结构域。除了成员间具有相同的同源结构域外， Rel．A，Rel．B和c．Rel分子还具有转录激活结构域，在功能上两个结构域也有 所区别，转录激活结构域主要负责NF—KB二聚体的激活与转录。核定位序列结 构域可以介导Rel．A进入细胞核内并通过Rel．A、Rel．B和c．Rel所特有的转录 激活结构域介导Rel．A的基因转录。Rel．A的磷酸化和乙酰化是影响NF．1出活 化并启动转录调控的关键，目前对NF．v．B活性调控的研究重点主要集中在对 Rel．A的蛋白修饰。当丝氨酸276受到激酶刺激后，改变了非磷酸化状态下Rel．A 的分子结构，增强Rel．A与环腺苷酸应答元件结合蛋白的结合，从而提高NF．v．B 的转录活性。因此我们推测通过干扰Rel．A基因表达，影响Rel．A的磷酸化程 度，进而减弱NF．v,B的转录活性来获得致耐受树突细胞。 RNA干扰技术是通过细胞导入外源性和内源性dsRNA在生物体内诱导同 源靶基因的mRNA序列特异性降解，从而引起转录后基因沉默的现象。由于 RNA诱导沉默复合物可以二次利用并经过RNA聚合酶的催化，因此在整个过 程中可以催化以并放大RNA的效果。siRNA导入技术的发展为RNA干扰技术 的应用提供了更多的选择，各种病毒介导的siRNA表达是最为有效的一类载体。 慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，虽然 属于逆转录病毒载体的范畴。它有着更广泛的宿主对分裂细胞和非分裂细胞均 具有感染能力，载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，有效对抗转 录沉默作用从而达到持久性表达，载体中可以插入特异性的启动子和增强子， 提高转入基因的转录靶向性，使慢病毒载体中的目的基因在特定的组织细胞中 表达。 本课题在前期研究和最新进展的基础上，构建大鼠角膜移植免疫排斥模型， III 万方数据 摘要通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IL．4共培养诱导分化大鼠骨髓源性树突细 摘要 通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IL．4共培养诱导分化大鼠骨髓源性树突细 胞，采用RNA干扰技术，筛选出高效抑制Rel．A表达的siRNA序列，构建针 对Rel．A的siRNA慢病毒载体细胞，将慢病毒载体转染至骨髓源性树突细胞， 降低NF一1(B表达及活性，以求获得稳定致耐受树突细胞的新方法，同时将该致 耐受树突细胞注入大鼠角膜移植模型，探寻Rel．A低表达的致耐受树突细胞诱 导大鼠角膜移植免疫耐受的作用及机制，为临床角膜移植诱导免疫耐受治疗免 疫排斥反应提供理论和实验依据。 第一部分大鼠骨髓源性树突细胞的体外诱导分化及生物学性能检测 研究目的 结合最新研究进展，进一步探讨体外诱导分化具有未成熟树突细胞表型和 致耐受特性的树突细胞的方法。 研究方法 本部分实验根据不同培养周期诱导大鼠骨髓源性前体细胞分化为未成熟树 突细胞。通过显微镜观察不同培养时间中树突细胞的生长及形态特征；通过流 式细胞仪检测诱导分化后树突细胞的表面标志物CD80、CD86和MHC—II的阳 性表达率；通过混合淋巴细胞反应实验验证不同培养时间诱导分化的未成熟树 突细胞是否具有致耐受树突细胞的生物学特性；并使用酶联免疫吸附实验鉴定 树突细胞培养上清中的IFN吖表达水平。 结果 培养至第六天和第八天的树突细胞在CD80、CD86和MHC—II的阳性表达 率方面明显低于(p0．05)培养至第十天的树突细胞；培养至第六天和第八天 的树突细胞在混合细胞反应中的吸光值明显低于(pO．05)培养至第十天的树 突细胞；树突细胞培养上清中的IFN吖表达水平在三组间逐渐升高。 结论 持续培养至第六天时收获的树突细胞具有未成熟树突细胞的表型并且具有 IV 万方数据 博士学位论文致耐受树突细胞的生物学特性。体外诱导大鼠骨髓性树突细胞分化为致耐受树 博士学位论文 致耐受树突细胞的生物学特性。体外诱导大鼠骨髓性树突细胞分化为致耐受树 突细胞过程中对培养时间和诱导分化培养液的精确调整极为敏感，树突细胞表 面标志物的特异性表达不能作为鉴定致耐受树突细胞的唯一标准。 第二部分构建p65低表达慢病毒载体和慢病毒转染对树突细胞生 物学性能及细胞因子影响 研究目的 设计针对p65低表达的siRNA序列，建立慢病毒载体系统并验证其对靶基 因的沉默效果，将慢病毒转染至诱导分化后的致耐受树突细胞，进一步探讨针 对p65低表达的慢