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解放军医学院硕士学位论文SEPPl高甲基化在VHL野生型肾透明细胞癌发生中的作用和机 解放军医学院硕士学位论文 SEPPl高甲基化在VHL野生型肾透明细胞癌发生中的作用和机 制研究 中文摘要 目的：1．利用基因芯片技术筛选出在VHL野生型和VHL突变型的肾透明细胞癌 (clearcell renalcell carcinoma，ccRCC)中甲基化程度及表达程度均有差异的基因， 在ccRCC原代培养细胞及肿瘤组织中对差异进行验证。2．构建目的基因表达载体 及稳转细胞株，通过一系列功能试验研究目的基因在ccRCC的发生中发挥的功能， 对VHL野生型肾透明细胞癌的发生机制进行补充。 方法：1．对ccRCC的新鲜肿瘤组织进行细胞传代培养，在得到的稳定传代培养的 肿瘤细胞株中(均进行过Str鉴定)根据患者性别、年龄、肿瘤的Furman分级、 肿瘤直径进行配对分组，筛选出5例VHL突变及5例VHL野生型的ccI℃C。提 取这10个ccRCC的总RNA．进行Affymetrix HTA2．0表达谱芯片检测：提取这 10个CCRCC的总DNA，进行Illumina 450K甲基化芯片检测。2．提取20例VHL 突变和20例VHL野生型的原代培养细胞的总RNA，逆转成cDNA，利用RT-PCR 的方法验证表达谱芯片结果。3．提取20例VHL突变和20例VHL野生型的原代培 养细胞的总DNA并进行硫化，利用甲基化特异性PCR的方法验证甲基化芯片结 果。4．使用SequenomMassArray甲基化检测方法检测目标基因CpG岛甲基化程度。 5．使用Western-blot及免疫组化方法检测目标基因SEPPl在VHL突变和VHL野生 型ccRCC组织中的表达情况。6．以人胚肾细胞株293T细胞的cDNA作为模板， 通过PCR方法获得人SEPPl全长序列片段，并与慢病毒表达载体plv-EGFP(2A) Puro质粒相连接，获得重组plv-EGFP(2A)PUlO．SEPPl载体并进行基因测序验证。 将重组慢病毒载体与包装质粒共同转染293T细胞，进行病毒包装。用病毒上清感 染肾透明细胞癌细胞株786-0和769-P，得到稳转细胞株。7．使用Western blot方 法检测SEPPl蛋白表达情况。按照重组慢病毒载体感染细胞株、空载体感染细胞 株、未经感染细胞株进行分组，并通过MB检测法、细胞平板克隆形成实验、细 胞周期试验对细胞的增殖能力进行评估。 万方数据 解放军医学院硕士学位论文结果：1．表达谱芯片中筛选出80个差异倍数大于1．5且PO．05的编码基因。在其 解放军医学院硕士学位论文 结果：1．表达谱芯片中筛选出80个差异倍数大于1．5且PO．05的编码基因。在其 中筛选出12个改变倍数2的编码基因并利用RT-PCR在原代培养细胞中进行验证。 结合文献报道及基因已知的功能，选择SLC34A2，CXCL5，SULTlC4，AKAPl2， SEPPl进行验证。2．从甲基化芯片中选择甲基化改变明显且在表达谱芯片中存在 差异的四个基因：SLUTlC4、SEPPl、SLC34A2和AKAPl2，利用MSP和Sequenom MassARRAY甲基化检测，其中SEPPl在VHL突变型和VHL野生型CCRCC中的 甲基化差异得到验证。3．利用western-bbt和免疫组化方法，SEPPl的表达差异在 组织中得到验证。4．plv-EGFP(2A)PUtO．SEPPl重组慢病毒表达载体构建成功，经 其感染的786．O、769-P细胞株在转染48h后在荧光显微镜下可见绿色荧光表达显 著。 SEPPl 蛋白表达水平均明显提高。5．M髑实验结果提示 plv-EGFP(2A)Puro．SEPPl感染组的细胞增殖能力降低(P0．01)。6．平板克隆形成 实验结果显示。SEPPl过表达细胞系集落形成能力明显降低(P0．001)。7．周期 试验提示SEPPl过表达引起肾癌细胞G2／M期阻滞。 结论：1、利用芯片技术及多个验证试验筛选出在VHL突变型和VHL野生型ccRCC 中甲基化水平和表达水平均存在差异的基因SEPPl。2、成功构建重组慢病毒袁达 载体plv-EGFP(2A)Puro．SEPPl，在786．O、769．P细胞株中过表达的SEPPl可引起 细胞周期G2／M期阻滞，并显著降低细胞增殖能力。 【关键词】肾透明细胞癌；DNA甲基化：VHL基因；Affymetrix HTA2．0表达谱芯 片：Ilhmina 450K甲基化芯片：SEPPl基因：硒蛋白P：慢病毒表达载体；肿瘤 增殖 2 万方数据 解放军医学院硕士学位论文Hypermethylation 解放军医学院硕士学位论文 Hypermethylation of SEPPl promotes the