对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用水生生物学专业论文.docxVIP

对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒 对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒 检测抗体芯片的制备与应用 学位论文完成日期： 2Q!!生三且 答辩委员会成员签字： 德～ 指导教师签字： 够雨砑小．， 饧吁：敞 ％，弓 y ％ ‘ )豸彩 砖 骷 跆锈纷 惜 独创 独创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 ．(注!如遗直墓丝益墨挂型直明的：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：余弧q签字日期：加ff年岁月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学”中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位敝储躲涂锄1 导师粹7渺玳 签字日期：2011年j月∞日 签字日期：2_011年j月；。日 对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒 对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用 对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒 检测抗体芯片的制备与应用 摘 要 病毒性疾病严重威胁着水产养殖业的健康快速发展。鉴于目前病毒病尚无有 效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一 种多样品、多指标检验并行处理的简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病 毒病的防控具有重要意义。新兴的抗体芯片技术结合了抗原抗体反应的特异性和 芯片高密度集成优势，只需少量生物样品，一次检测便可获得几种甚至几万种有 关的生物信息或疾病的检测结果，在人类疾病中病原／疾病标志物等的检测上己 显示出广阔的应用前景。但尚未发现有利用抗体芯片法检测水产动物病毒的相关 报道。本文将单克隆抗体(单抗)技术、免疫标记技术和抗体芯片技术相结合， 以目前水产养殖中的重要病毒病的病原对虾白斑症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)和鱼类淋巴囊肿病毒(Lymphocystis Disease Virus，LCDV)为模式 病毒，建立了水产动物病毒检测抗体芯片制备体系，优选了芯片载体，优化了反 应条件，研究了点样缓冲液、抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、抗原． 抗体反应时间、不同标记显色方法等对芯片灵敏度的影响，制备了对虾WSSV 检测抗体芯片和鱼类LCDV检测抗体芯片，并将其用于WSSV／LCDV的检测。 具体研究结果如下： 1．针对芯片载体的选择和处理是制备高质量抗体芯片的关键，本文制备了 琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、APES、醛基、巯基、多聚赖氨酸修饰玻片，综合 分析了以上6种不同修饰的玻片及氨基化玻片、硝酸纤维素(NC)膜、PVDF膜 共9种不同载体对抗体的固定效率和效果。结果显示1．2％琼脂糖凝胶修饰玻片表 面信号点圆润、均匀，无边缘扩散和拖尾现象，信号值最高，而其他载体都有不 同程度的拖尾现象，表明琼脂糖凝胶修饰玻片对抗体的固定能力和固定效果最 好。原子力显微镜显示琼脂糖凝胶修饰玻片表面为均匀的三维多孔结构，平均表 面粗糙度为18．6 nm，结合琼脂糖凝胶表面经Nal04活化后的醛基基团，能够以物 理吸附和共价结合的方式牢固的固定抗体。因此后续实验采取琼脂糖凝胶修饰玻 片作为抗体芯片的载体。 中国海洋大学博士学位论文2．以WSSV／LCDV病毒粒子为模式病毒，采用双抗体夹心方式建立了水产 中国海洋大学博士学位论文 2．以WSSV／LCDV病毒粒子为模式病毒，采用双抗体夹心方式建立了水产 动物病毒的抗体芯片检测体系。提纯WSSV／LCDV病毒粒子，制备病毒的兔抗 血清，纯化后进行特性分析。结果显示纯化后得到了高活性、高效价的兔抗WSSV 及兔抗LCDV抗体，效价分别为1：64000和1：32000。 复苏本研究室前期制备的WSSV／LCDV单抗杂交瘤细胞株，采用腹水生产 方法获得大量WSSV／LCDV单抗，辛酸硫酸铵法结合Protein G亲和层析纯化后 进行特性分析。结果显示纯化后WSSV／LCDV单抗效价均为l：32000，具很好的 活性。采用Cy3抗体标记试剂盒(