目的基因克隆.doc

一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？ 1、主要有以下几个克隆的策略： （1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。 （2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。 （3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。 2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。 二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？ 1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。 2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。 3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。 三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？ 1、基因文库筛选方法 通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交； PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置 96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。 2、图位克隆目的基因 利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，用获得的与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因文库的方法。主要有染色体步移法、染色体登陆、跳查和连接法；外显子捕捉和cDNA直选法等。 3、插入突变分离克隆目的基因 由重组DNA 技术衍生出的插入突变，可人为地造成某一待研究基因的突变，并可根据由此带来的表型特征的改变分析该基因的功能。基因插入突变的方法主要有：插入失活突变；T－ DNA标签；转座子标签。 4、相邻片段的体外克隆 （1）Panhandle PCR法 在限制酶消化的DNA 3＇端加一个与未知序列上游已知序列互补的单链引物，从而使经变性后产生的单链DNA分子内聚合，导致已知DNA定位于未知相邻DNA侧翼区段。引物设计是该技术运用的关键所在，所需引物包含一个与已知序列上游互补的单链引物和两对位于该单链引物两侧与已知序列一致的引物。 （2）Cassette PCR法 利用Cassette及Cassette引物特异性快速扩增cDNA及基因组DNA未知区域的一种有效方法。由于Cassette的5＇端没有磷酸基，在目标DNA的3＇端和Cassette的5＇端的连接部位形成缺口，在第一次PCR反应的第一循环时，从引物C1开始的延伸反应在连接部位终止，从而控制了非特异性的扩增。只有从引物S1开始延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行DNA的扩增反应。再用内侧引物(引物C2,引物S2)进一步进行第二次PCR反应时，能高效特异性地扩增目的DNA。 克隆目的基因的方法： 若目的基因的序列未知，则采用相邻片段的体外克隆的方法；若目的基因的序列已知，有现成的基因文库，则采用基因文库筛选方法较好；若有合适的分子标记，则用图位克隆的方法较好；若需研究目的分子的功能，则采用插入突变分离克隆目的基因的方法较好。 四、功能基因组学策略克隆目的基因的方法有哪些？各有什么特点？如何解决其中的假阳性克隆问题？ 1、RT-PCR扩增 这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。 2、mRNA差异显示技术 该方法以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础，实验简便，灵敏度高，耗时短，可同时比较多个样品间基因表达的差异，可同时检测到上调和下调的基因，但这种方法对低丰度的mRNA检出率低，得到的绝大多数差异条带仅含3’UTR短片段信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因且容易出现假阳性。 假阳性的鉴定： （1）Northern杂交：通常是将序列胶中回收的片段再次扩增后作探针进行Northern杂交检测