多色实时pcr用于食源性致病菌的广谱检测与识别生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

英文缩写索弓英文缩写索引 英文缩写索弓 英文缩写索引 76 厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权 利和责任。 声明人(签名)：非往事 加叼年7月“日 厦门大学学位论文著作权使用声明本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1、保密( 年解密后适用本授权书。 2、不保密 (请在以上相应括号内打“√”) 作者签名：积往啐 日期：07年7月“日 导师签名：夕懒， 日期：叩年7月，珀 摘要摘 摘要 摘 要 快速、有效、高通量地对食源性致病菌进行检测与识别对于疾病预防与控制 十分重要。食源性致病菌多种多样，如何从一系列怀疑对象中确定特定的病原已 成为亟待解决的重要课题。本论文综合运用实时PCR、多色组合探针编码 (MCPC)技术和相同标签辅助．无引物二聚体(HAND)系统，致力于对食源性 致病菌的广谱检测与识别。 第一章，综述食源性致病菌的检测现状，介绍传统检测方法、免疫学检测方 法和分子生物学检测方法的应用现状及发展趋势。针对目前实时PCR存在检测 通量偏低的问题，分析其中的技术瓶颈，提出采用多色组合探针编码技术的思路。 第二章，通过改良分子信标．多重荧光PCR的方法实现食源性致病菌的广谱 检测。本章选择7种致病弧菌作为研究对象，通过两个四色实时PCR体系实现 了7种弧菌的同时检测，该体系具有特异性好、灵敏度高、快速简便等优点。第 一个四色实时PCR体系能同时对01群霍乱弧菌、0139群霍乱弧菌、副溶血弧 菌及其毒力株进行检测，对单一目标菌的检测灵敏度可达29．6．630 CFU／反应； 第二个四色实时PCR体系能同时对创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌和河弧菌进 行检测，对单一目标菌的检测灵敏度可达29．5．295 CFU／反应。 第三章，通过广谱PCR结合置换探针基因分型的方法实现食源性致病菌的 广谱检测与识别。通过广谱PCR扩增食源性致病菌的16S rRNA和23S rRNA基 因的保守区域，利用双链置换探针．MCPC技术针对扩增产物的差异序列区分不 同产物，实现了在单管中对9类常见食源性致病菌的识别。该方法覆盖常见的食 源性致病菌，包括致病性大肠杆菌和志贺菌、沙门菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢 杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、变形杆菌和化脓性链球菌。对 129株菌株的分型结果与已知的鉴定结果一致。 第四章，以特异基因作为靶标，建立HAND系统结合改良分子信标．MCPC 技术的方法实现食源性致病菌的广谱检测与识别。以7种致病弧菌作为研究对 象，通过HAND系统结合MCPC技术，在一个PCR管中实现了对01群霍乱弧 菌、0139群霍乱弧菌、副溶血弧菌及其毒力株、溶藻弧菌、河弧菌、拟态弧菌 和创伤弧菌任意一种模板的检测。该方法具有灵敏度高(检测灵敏度为2．100拷 摘要贝／反应)，特异性好，检测通量高(一次能分辨7种靶序列的任意一种)，在宽 摘要 贝／反应)，特异性好，检测通量高(一次能分辨7种靶序列的任意一种)，在宽 泛的模板浓度范围(至少6个数量级)内具有良好的定量能力(R20．99)。该方 法通过了145株菌株的特异性验证，证明其结果可靠、准确。 本论文利用多色实时PCR技术提供了针对食源性致病菌广谱检测与识别的 三种解决方案，这些方法具有操作简便、快速特异等优点，有望为食源性致病菌 的检测提供有力的技术手段。 关键词：置换探针；改良分子信标；多色组合探针编码 2 A A BSTRACT ABSTRACT Foodbome bacterial pathogens are recognized as one of the major etiological agents that cause foodbome disease．The availability of rapid，specific and high throughput assays tO detect the presence or absence，or even the degree of contamination of pathogens，has