肠外致病性大肠杆菌icmf基因功能研究和侵入脑微血管内皮细胞相关基因的筛选预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文2．4．3基因缺失突变株AicmF的生长特性 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 2．4．3基因缺失突变株AicmF的生长特性 ．17 2．4．4细菌运动能力检测 ．．18 2．4．5生物被膜形成能力检测 一18 2．4．6耐药性测定 。19 2．4．7粘附与侵入HBMEC能力的比较 ．．19 2．4．8抗巨噬细胞吞噬及吞噬后存活能力检测 。20 2．4．9巨噬细胞毒性检测 ．．21 2．5讨论 22 2．6结{念 24 第3章RS218突破血脑屏障相关毒力因子的筛选 一25 3．1目的与意义 ．25 3．2实验材料 ．25 3．2．1菌株、细胞与质粒 一25 3．2．2酶和相关试剂 ．．25 3．2．3主要仪器和设备 ．．25 3．2．4培养基和试剂的配制 。25 3．2．5 PCR引物 ．．26 3．3实验方法 ．26 3．3．1突变体库的构建和质量检测 。26 3．3．2突变株侵入HBMEC能力的初步筛选 。27 3．3．3候选突变株生长能力的检测 。27 3．3．4候选突变株侵入率的测定 ．．27 3．3．5 TAIL．PCR扩增Tn5侧翼序列 28 3．3．6突变位点定位 ．．29 3．4结果与分析 ．29 3．4．1突变体库的构建和质量检测 。29 3．4．2突变株侵入HBMEC能力分析 一30 3．4．3候选突变株生长能力的检测 。30 3．4．4候选突变株侵入率测定 。3 1 3．4．5候选突变株突变位点的确定 ．．32 3．5讨论 34 3．6结论 36 参考文献 37 致谢 45 万方数据 肠外致病性大肠杆菌icmF基因功能研究和侵入脑微血管内皮细胞相关基因的筛选摘要 肠外致病性大肠杆菌icmF基因功能研究和侵入脑微血管内皮细胞相关基因的筛选 摘要 肠外致病性大肠杆菌是一类在特定情况下能引起宿主肠道以外组织感染的病原 菌，主要引发肺部感染、泌尿系统感染和脑膜炎等。尽管已经有很多毒力因子被报 道参与了上述致病过程，但仍有许多细节未得到清楚的解释。细菌VI型分泌系统已 被鉴定存在于包括肠外致病性大肠杆菌在内的多种致病菌中，在细菌致病过程中起 到重要作用。本课题利用实验室前期构建的大肠杆菌VI型分泌系统基因缺失株 Ahcpl一3和新构建的icmF基因缺失株AicmF，研究icmF基因在猪肠外致病性大肠 杆菌PCN033中的作用。主要取得以下结果：(1)成功利用正反筛选系统构建了icmF 基因敲除突变株，并改进了突变株的筛选方法。(2)表型实验结果显示，T6SS相关基 因缺失并不影响细菌的生长、运动和抗药能力，但能显著增强细菌形成生物被膜的 能力。(3)细胞实验结果显示，T6SS功能的缺失导致细菌粘附、侵入上皮细胞能力增 强。另外，T6SS功能的缺失并不影响细菌对巨噬细胞的毒性，但极显著的降低了细 菌抵抗巨噬细胞吞噬和在巨噬细胞内存活的能力。在所有的表型检测中，AicmF和 Ahcpl一3的表现基本相同，可以初步认为icmF基因功能与T6SS紧密相关。 为了进一步了解致脑膜炎大肠杆菌的致病机制，本研究进一步构建了脑膜炎模 式菌株RS218的Tn5转座子突变体库。以人脑微血管内皮细胞为模型，筛选侵入能 力缺陷的突变株。通过对764株突变株的筛选，初步获得33株侵入能力明显下降的 突变株。进一步通过检测候选突变株的生长速率，筛选掉2株生长速率下降的突变 株。经细胞侵入实验的复检，最终获得31株突变株对HBMEC的侵入率。采用 TAIL．PCR技术，获得了Tn5插入位置一侧的基因组序列，经测序和序列分析，定 位到29个基因内部插入和两个基因间插入。其中有一个突变发生在已报道参与细菌 突破血脑屏障的fimH基因内。本研究的筛选结果为后续大肠杆菌致脑膜炎的机制研 究奠定了基础。 关键词：肠外致病性大肠杆菌；icmF基因；VI型分泌系统；人脑微血管内皮细胞； 转座子突变体库 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文Abstract 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 Abstract Extraintestinal pathogenic Escherichia coli(ExPEC)Call cause opportunistic infections in extraintestinal organs，like lung infections，urinary tract infections，and meningitis．Although many virulence factors have been identified，the pathogenesis is still not clear．Many kinds of pathogenic bacteria