两种过氧化物还原酶在日本囊对虾先天免疫中的功能研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

山东大学硕士学位论文7．埘Prxl的Cys51位在其促进wSSV复制的功能中发挥关键作用 山东大学硕士学位论文 7．埘Prxl的Cys51位在其促进wSSV复制的功能中发挥关键作用 31 四、讨论 ．．32 第三章1．Cys亚型过氧化物还原酶在日本囊对虾抗细菌免疫中的功能与分子机理研究 35 一、前言 ．35 二、实验材料与方法 ．．36 1．实验材料 36 1．1实验动物 36 1．2菌株与质粒 36 1．3实验试剂 36 2．实验方法 ．37 2．1细菌感染 ．．37 2．2组织总IⅢA、蛋白提取 37 2，3 cDNA逆转录合成 37 2．4重组表达载体的构建 ～38 2．5重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备 ．．38 2．6蛋白质免疫印迹(wbst哪Blot) 39 2．7 RNA干扰实验 39 2，8存活率统计实验 j ．39 2．9实时定量PcR和半定量RT-PcR 39 2．10细菌清除实验 39 2．11对虾体内H202测定 ～40 2．12注射抗氧化剂NAC和外源H202 40 2．13重组蛋白回补实验 40 三、实验结果 ．42 1、均P仪6在日本囊对虾抗细菌免疫中发挥重要作用 一42 2、干扰坳Ⅸ6抑制鳗弧菌感染诱导的A^俨基因上调表达 44 3、坳脯6干扰引起对虾体内H202水平的异常升高 47 4、NAC能够修复岣勿腻6干扰引起的H202异常升高和御护基因表达抑制 48 5、』岬弘J、岣爿{『℃J和弼徂班2基因的表达受H202浓度的双向调节 50 6、J^彩P怯6重组蛋白能够修复蟛岍6干扰组对虾的异常表型 51 7、岣爿{，℃J和蚜4口眈在对虾抗细菌先天免疫中发挥重要功能 ．54 四、讨论 55 参考文献 ．59 已发表或整理的文章 ．65 致谢 67 万方数据 山东大学硕士学位论文 山东大学硕士学位论文 两种过氧化物还原酶在日本囊对虾先天免疫中的功能研究 摘要 研究背景 先天免疫是生物体在长期的进化中获得的一种抵御外界病原微生物入侵的 天然防御机制，是宿主启动免疫应答的基础。无脊椎动物仅具备先天免疫系统， 因而是研究先天免疫应答机制的理想生物。无脊椎动物先天免疫研究在以果蝇和 线虫为代表的模式生物中取得了较大的进展，获得了深入的认识。近年来，以对 虾为代表的海洋无脊椎动物养殖业发展迅速，但也频繁遭受病害的侵袭。因此， 需要深入研究对虾的先天免疫应答机制，为相关产业的病害防控提供理论参考与 技术支持。 研究的科学问题及意义 己知，在需氧生物中，由过氧化物歧化酶和过氧化氢酶等组成的抗氧化酶系 统在生物体的先天免疫应答中发挥着重要功能。近期的研究成果表明，过氧化物 还原酶(Peroxiredoxin，PD【)，作为一类多功能的、广泛分布的硫醇依赖性的抗氧 化酶，可能参与先天免疫应答。但是，其在先天免疫应答中的具体功能和发挥作 用的分子机制尚不明确。因此，在本论文中我们选择具有重要经济价值的无脊椎 动物日本囊对虾作为实验材料，深入研究PD【1亚型在对虾抗白斑综合症病毒 (Wllite spot syIldrome vims，wSSV)先天免疫和1一Cys Prx6亚家族蛋白在对虾抗 细菌先天免疫中的功能及其作用机制，以期能够揭示这类抗氧化蛋白在动物先天 免疫应答中的功能与分子机理，为深入理解动物体内抗氧化酶系统在免疫应答中 的功能和对虾病害防控提供帮助。 研究结果 l、必严Ⅸl通过介导Nl-KB同源蛋白岣Dorsm二聚化．促进胸Dorsal与病毒 拓j启动子的结合，促进wssV在对虾体内的复制 受wSSV感染后，昀．PⅨ家族成员在日本囊对虾鳃组织中呈现不同的表达变 化，其中岣P玎【1呈现出最为显著的上调表达。RNA干扰实验表明，干扰坳J 基因的表达能够提高wssV感染对虾的存活率，抑制wSSv在对虾体内的复制； 万方数据 山东大学硕士学位论文而注射纯化的均P玎【l重组蛋白则能够降低WSSV感染对虾的存活率，促进 山东大学硕士学位论文 而注射纯化的均P玎【l重组蛋白则能够降低WSSV感染对虾的存活率，促进 wSSV在对虾体内的复制，表明在对虾体内胸．Pr)【1发挥促进wssV复制的功能。 免疫细胞化学和染色质共沉淀实验证实，干扰蚴p肠J『基因的表达能够抑制wssV 感染引起的核因子KB(NuclearfactorkappaB，NF一1cB)同源蛋白岣Dorsal的核移位 及其与病毒极早期基因把J启动子的结合活性。免疫共沉淀结果显示：在对虾体 内，均PrXl能够与聊Dorsal相互作用，形成二硫键连接的异二聚体形式；而且 wSSV感染能够显著促进二者的相互作用。细胞实验表明，蛳Prxl蛋白能够与 蚴Dorsal中的Rel同源结构域(Rel hoInolog domain，RHD)以二硫键连接的方式 形成异