胚胎冷冻保存技术..ppt

胚胎冷冻保存技术简介 毛 菲（中 药） 郑志琪（生物技术） 张建飞（生物技术） 魏 彬（生科基地） 1 总论 2 冷冻损伤及保护 3 冷冻过程 　胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎或卵母细胞在-196℃的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。 概 念 图为世界首例冷冻胚胎克隆水牛“盼盼”（左）与“代孕妈妈”在一起 原 理 冷冻保存,是将体外培养物悬浮在加有或小加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速度降至零下某一温度，对其长期保存的过程。此时细胞的代谢活动被完全抑制，使细胞的生命在静止状态下保存来，从而达到长期保存的目的。 意 义 　胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率； 　长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施； 便于国际间交流； 　替代种畜引种。 冷冻损伤原因 胚胎的冷冻是一个脱水过程，冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。 在冷冻过程中，胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶，一方而对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤，另一方而导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高，造成蛋自质变性即溶液损伤。 诱发结晶 使用冷冻保护剂 玻璃化 损伤保护 诱发结晶 在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。 使用冷冻保护剂 玻璃化 损伤保护 诱发结晶 使用冷冻保护剂 冷冻保护剂渗入到细胞内后，能增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的驱动力减弱，减少冰晶的形成。 玻璃化 损伤保护 ⑴ 渗 透 性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO等，防止溶质效应。 ⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。 冷冻保护剂 特点：分子量小于100，易于渗透 特点：分子量大，不进入细胞 诱发结晶 使用冷冻保护剂 玻璃化 玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。 损伤保护 一，保护剂的加入 大都采用一步法加入保护剂。胚胎移入保护液时温度应为18~20℃，平衡时间为15~25min。 二，装管 胚胎冷冻一般采用0.25ml精液冷冻细管。 将细管有棉塞的一端插入装管器。 按保护液（Ⅰ段）→气泡→胚胎和保护液（Ⅱ段）→气泡→保护液（Ⅲ段）顺序装管。 在实体显微镜下检验胚胎是否装入管内。 封管。 冷冻过程 冷冻过程 三，保存 常规冷冻法 一步冷冻法 玻璃化冷冻法 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 　　　　1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。 操作流程： （1）抗冻液中平衡：室温下（20-25℃），在含有1-2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。 常 规 冷 冻 法 （2）植冰（诱发结冰）： 植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。 目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。 　　　将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法诱发结冰。 常 规 冷 冻 法 （3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓慢降温。 以0.33℃／分钟降至－30-－35℃时投入液氮； 以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮； 以0.5℃／分钟降至－30-－35℃时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。 常 规 冷 冻 法 （4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室温或37℃水浴中解冻。 （5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 常 规 冷 冻 法 也叫一步细管法。 该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的