狗脊多糖对软骨细胞增殖及氧自由基影响的实验研究中西医结合临床专业论文.docxVIP

结论 结论 。19 参考文献 。20 致谢 -．24 作者简历 31 万方数据 缩略词表IV 缩略词表 IV 万方数据 中文摘要目的 中文摘要 目的 本研究旨在观察狗脊多糖对体外培养大鼠软骨细胞增殖和氧自由基的影响，为其在 骨关节炎的临床应用提供理论依据。 方法 1、本实验用水提醇沉、Sevag法除蛋A提取纯化获得狗脊多糖，通过苯酚一硫酸比色 法测定狗脊多糖含量。 2、采用机械．酶消化法分离SD大鼠膝关节的软骨细胞，建立体外培养并鉴定软骨细 胞，使用倒置显微镜镜下观察软骨细胞形态；MTT法检测狗脊多糖对软骨细胞增殖特性 的影响；流式细胞术检测经狗脊多糖干预的软骨细胞周期变化的影响；RT．PCR、Western Blot分别检测软骨细胞周期相关基因与蛋白的表达；酶联免疫吸附测定法分别检测软骨细 胞液中SOD、NO、MDA的含量。 结果 l、狗脊多糖含量为76．9l％，精密度实验RSD=I．86％，表明仪器精密度良好，且稳 定性试验RSD=I．98％，平均回收率试验为95．4％，RSD=I．83％。 2、第2代软骨细胞形态一致、胞核可视且清晰，生长状态良好；经甲苯胺蓝染色鉴 定其胞核为蓝色；经II型胶原染色后，阳性对照组胞浆区呈棕黄色。 3、MTT实验结果显示，狗脊多糖对软骨细胞增殖具有一定的时效．量效关系，其最 佳干预时间和浓度分别为48 h和200 pg／ml；流式细胞术检测结果显示，与空白组比较， 各实验组(100；200；400}I咖1)干预48 h后，以200 pg／ml组在G0／G1期所占细胞比例最低 (P0．01)，在S期最高(P0．01)；RT．PCR及Western Blot法检测结果显示，各实验组 (100；200；400 pg／m1)干预48 h后，CDK4、Cyclin D1、pRB的mRNA与蛋A表达均高于空 白组，且以200 pg／ml组表达最显著(P0．01)。 4、酶联免疫吸附法检测结果显示，与正常组相比，模型组SOD、NO、MDA含量 表达均有统计学意义(PO．01)，提示模型建立；与造模组相比，各实验组(100；200；400；800 “g／m1)干预48 h，可上调SOD、下调NO、MDA含量表达，其中以200 pg／ml组表达最 显著(P0．01 结论 1、狗脊多糖对软骨细胞增殖作用具有一定的时效．量效关系，其促增殖机制为通过抛 万方数据 高软骨细胞周期中Gl至S的转变率，并上调正性调控因子的基因与蛋白含量的表达。 高软骨细胞周期中Gl至S的转变率，并上调正性调控因子的基因与蛋白含量的表达。 2、狗脊多糖可降低经硝普钠造模后软骨细胞中异常氧自由基含量表达，上调抗氧 化因子水平，发挥抗氧化作用。 关键词：狗脊多糖，软骨细胞，增殖，氧自由基 万方数据 AbstractObj Abstract Obj ective To evaluate the effects of Cibotium barometz polysaccharides(CBPS)on proliferation and oxygen radical of chondrocytes cultured in vitro SO as to provide some evidences for clinical application of CBPS． Methods 1．The CBPS were extracted by hot water,alcohol precipitation and protein filtration with Sevag reagent；The content of the polysaccharides was determ ined by phenol—sulfuric acid colorimetry． 2．Establishment of chondrocytes system cultured in vitro isolated from knee articular cartilage of 4-week old SD rats；Morphological changes were observed by inverted phase contrast microscope；The effect of proliferation and the evaluation for the phase of cell cycle treated by CBPS were dected by MTT assay and flow cytometry respectively；The expression of related mRNA and protein on proliferation