副猪嗜血杆菌多脂多糖蛋白结合疫苗的制备及免疫原性研究预防兽医学专业论文.docxVIP

副猪嗜血杆菌脂多糖一蛋白结合疫苗的制各及免疫原性研究摘要 副猪嗜血杆菌脂多糖一蛋白结合疫苗的制各及免疫原性研究 摘要 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是存在于正常猪群上呼吸道的革拉 泽氏病(Glasser’s disease)的病原体，引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑 膜炎为特征的全身性严重疾病。HPS至少有15种抗原性和毒力的差异较大的血清 型，其疫苗缺乏效果显著的交叉免疫保护力。而脂多糖作为病原菌的一种血清型特 异的有效免疫原，可以刺激机体产生保护性免疫应答，但其免疫原性弱。若将多糖 和载体蛋白进行化学结合而制成偶联疫苗能较大的提高免疫原性。不同于其它文献 报道，本文未采用常用的蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、破伤风类毒素等，而是采用 副猪嗜血杆菌脂多糖与本实验实研究发现的具有良好免疫原性的副猪嗜血杆菌二型 分泌系统四型菌毛蛋白PilA进行共价偶联，以取得更好的免疫效果和更强的保护力。 本研究采用68℃热酚水法从副猪嗜血杆菌地方四型0322菌株及五型0165菌株 分别提取脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)。经还原性实验及紫外光谱分析验证所 提取的产物的主要成分即还原性的多糖。用酸水解法去掉带有毒性的脂质A部分， 经葡聚糖凝胶层析预装凝SephadexG．75柱过柱纯化出脂多糖的主要结构单位—— O．多糖侧链(O．specific polysaccharide，O．SP)。以己二酰二肼(ADH)为连接剂， 将脂多糖经碳二亚胺(EDCA)活化后与Pi认蛋白进行共价偶联，再经葡聚糖凝胶 层析预装凝SephadexG-75柱过柱纯化，分别制得针对副猪嗜血杆菌0322菌株的 OSP0322．PilA结合产物、针对副猪嗜血杆菌0165菌株的OSP0165．PilA结合产物和 针对二者的混合产物OSP0322．Pi认+OSP0165．Pi执。用此三种结合产物分别免疫雌 性BalB／C小鼠，并做副猪嗜血杆菌灭活苗和佐剂对照组。分别在第一次和第二次免 疫后的第14天对小鼠进行尾部采血，用ELISA法检测血清的抗体OD630值。结果 显示佐剂对照组免疫后，小鼠血清中没有抗LPS的IgG抗体产生，而用三组 OSP．PiIA免疫后小鼠血清中均产生了抗LPS的IgG抗体，且三组OSP．Pi认免疫组 在第二次免疫后第14天IgG抗体较第一次免疫后第14天的水平均有显著的提高， 表明OSP．PilA结合产物具有良好的免疫原性。在第二次免疫后第14天分别用 2xLD50和5 x LD50的HPS0322和HPS0165对小鼠进行攻毒实验，结果显示 OSP0322．PilA和OSP01 65．PilA两组结合产物在攻毒剂量为5×LD50都表现较高的 保护力。而OSP0322．PilA+OSP0165．PilA结合产物组的小鼠死亡率较大，不具备了 良好的保护力。 关键词：副猪嗜血杆菌；脂多糖；PilA蛋白；脂多糖．蛋白结合疫苗；免疫原性 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文Abstract 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 Abstract Haemophilus parasuis is one of the comrnensal bacteria which colonize the upper respiratory tract of pigs．Under some appropriate conditions，月=parasuis can infect and cause severe systemic disease(Gl{iSser’S disease)，characterized by polyarthritis， fibrinous polyserositis，meningitis and pneumonia．月=parasuis has more than 1 5 distinct serotypes．The antigens and virulence varied among H parasuis strains of different serotypes，thus the vaccines for H parasuis lack cross-protection efficiency．Therefore， development of sensitive，specific and CROSS—protective vaccines is critical for月=parasuis prevention．Lipopolysaccharides(LPS)are important and effective immunity units of bacteria,