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免疫组化实验方法 免疫组织化学的概念 利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 * 最突出的优点 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能。 * 免疫组化实验标本 组织标本（石蜡切片和冰冻切片） 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂片）。 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档； * 细胞和组织的固定 1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。 2．选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。 （1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。 （2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。 （3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究） 组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够（20倍） * 抗体 常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 特性比较： 均一性 2. 稳定性 3. 特异性 4. 重复性 5. 沉淀反应 * 染色的基本程序 ①标记抗体与标本中抗原反应结合； ②用缓冲液洗去未结合的成分； ③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。 * 反应条件 抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件： （1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成 （2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成 （3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.1～1%） （4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白 （5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇 * 荧光素 1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。最常用。 2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。 3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～600nm，呈橙红色荧光。价廉。 * 染色注意事项 （1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。 （2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右） （3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。 （4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。 （5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。 （6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。 * 酶标抗体法 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。 * 抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC) 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不