番茄中乙烯信号转录因子leerf1和leerf2调控机制研究食品科学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 卡I．【物一p内源激素乙烯影响植物的生长和发育。调控乙烯反应是由乙烯信号转导途径米完成 的。乙烯反应元件结合蛋白(EREBPs)是乙烯信号转导途径中的下游传递元件，在植物中通过 调控相关基囚的转录和表达来调控乙烯反应。LeERFl和LeERF2基因属于EREBPs家族成员，含有 典型的ERF结构域。为了进一步研究它竹J的调控机制，本论文做了以r几方面工作： (1)克隆和鉴定￡彪wF，平口￡P翻F堪因：通过RT-PCR方法从破色期番茄果实中克隆LeERFl 7f11LeERF2基因．PCR产物被亚克隆剑原核=挺达载体pET-30a上，在大肠杆菌BL21中筛选到含有目 的基因的重组质粒pET-LeERFl和pET-LeERF2。 (2)表达和纯化LeERFl和LeERF2蛋白：在大肠杆菌BL21中分别表达外源蛋白LeERFI和 LeERF2，采用诱导温度为37。C，诱导剂IPTG浓度为lmmol／L，诱导时间为3 h。LeERFl和LeERF2 衷达蛋白在细菌沉淀中约占菌体总蛋白53％}U 58％。应用Ni-NTA亲和层纯化回收LeERFl和 LeERF2表达蚩白纯度分别为96％和99％。凝胶阻滞实验表明，LeERFI和LeERF2表达蛋白均具 有与GCC盒结合特性。 (3)制备抗LeERFI和LeERF2多克隆抗体：免疫兔子制备抗LeERFl多克降抗体和抗LeERF2 多克隆抗体效价均大于10000，经过DEAE一52离子交换柱纯化它们纯度分别达剑r 980／d矾99％。 Western blotting检测表明，抗LeERFI多克隆抗体和抗LeERF2的多克隆抗体均具有免疫特异性。 (4)LeERFl亚细胞定位：通过胶体金免疫电镜定位的方法分析番茄果皮维管组织中LeERFI 的亚细胞分布状况。副f究表明．LeERFl蛋白主要分布在细胞核(N)、细胞核仁州u)和质体(P) 等部位，im在细胞壁(cw)和液泡(V)上几乎没有分布；破色期ff；茄果实中，LeERFI蛋白在细 胞核(N)、细胞核仁(Nu)和质体(P)中含量明显比绿熟期甭茄果实增多。Western blotting表 明，破色期番茄果实中LeERFl蛋白含晶比绿熟期番茄果实中LeERFl蛋白含量有明显增加。试 验结果表明，LeERFl与芥茄果实成熟卡日关。 (5)LeERFl结台启动子的分离和功能鉴定：通过LeERFI蛋白一DNA体外结合实验，克隆 了艮度分别为893bp和734bp的TLBPI和TLBP2两个基因片断，它们部含仃AGCCGCC(GCC 盒)，其中皿丑P，含有典型TATA box和CAAT box。GenBank比对结果表明，TLBPl和TLBP2 基因片段与编码番茄几丁质酶AY343058／AY343059／AY343060的启动子基因在核甘酸水平上同 源性达到80％以上。 (6)LeERFl蛋白和番茄果实病程胁迫的关系：采用番茄青霉菌(Penicillium expansum Link) 侵染绿熟期、破色期、粉红划和红熟期丽春番茄果实。研究表明，LeERFl随乙烯释放量的变化 而变化，在蛋白水平受乙烯调控；LeERFI蛋白与编码几丁质酶LECHll7基ⅢmRNA水平变化 趋势基本一致；LECHll7基冈mRNA水甲与几J‘质酶酶活具有相关性。试验表明，LeERFl可 能庄蛋白水平通过调控LECHII 7基冈的转录和翻译参与番茄果实的病程胁迫反应。 关键词：番茄，乙烯，信号转导，病程胁迫， EREBPs AbstractEthylene Abstract Ethylene is an endogenous plant hormone that influences many aspects of plant growth and development．Control of ethylene responses is conducted by ethylene signal transduction pathway． Ethylene Responsive Element Binding Proteins(EREBPs)are transcripttonal factors function in the ethylene signaling pathway in plants，helping to regulate ethylene responses by regulating genes transcription and expression．LeERFI and LeERF2 identified as members of the EREBPs family, characterized b，，a consen,ed