反式环氧琥珀酸水解酶的筛选及其异源表达生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

20 20 1 2年9月我正式成为浙江大学生物化学研究所333实验室的—名研究生， 时间总是这样快，两年多的研究生生活就要结束了．简单快乐的学习和生活离不 开导师的悉，黼，离不开实验室大家庭的热情帮助，离不开亲朋好友的衷心支 持，在此毕业之际，我真诚地向你们表示感谢： 感谢我的导师张建国副教授，感谢我的指导老师谢志鹏副研究员，你们严谨 的求是态度，深厚的理论基础，丰富的实践应用经验，敏锐的洞察力和清晰的科 研思路．让我受益匪浅，在你们的悉心指导与帮助下，我才得删I嘲叫完成学业。 感谢潘海峰师兄和鲍文娜师姐，是你们的热情帮助使我在短时间内适应了实 验室的生活和学习，感谢你们在我课题开展期间给予的指导和帮助，感谢你们在 这两年多的时间里给予的生活E的开导和关心。 感谢实验室的研究生程永青师姐、李博义师兄、张长领师弟、陈曦师妹，感 谢杭州宝晶生物股份有限公司的工作人员杨丹燕、胡海燕、董大路、寿宇捷、金 栋华，在我学习和生活中的帮助．使我能够愉快地度过两年多的研究生生活。 感谢生化所其他实验室的老师、同学在这两年多的学习中对我的支持和鼓 励。感谢学院各所的老师、同学在我担任研博会工作期间给予的支持和配合。 感谢百忙之中抽出时间评阅这篇论文的专家、老师。 最后，衷心感谢我的父母和姻姐对我的支持和关心，感谢男朋友李毅对我的 鼓励和督促。我—定会继续努力! 张振红 2015年1月 于浙大紫金港 万方数据 Amp Amp Ampicillin BSA Bovine Serum Albumin CESH Cis-epoxysuccinate hydrolase CGMCC China General Microbiological Culture Collection Center EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EH Epoxide hydrolase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl-pD-thiogalactoside Matrix-assisted laser desorption／Ionization time of flight MAI．DI．TOF．MS mass spectrometry MS Mass spectrometry NA保 Nuclear magnetic resonance 0NPG 0一Nitrophenyl-8一D—galactopyxanoside PVDF Polyvinylidene fluoride SDS Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TESH Trans-epoxysuccinate hydro lase V-P Vogas—Proskauer Ⅱ 万方数据 meso一酒石酸(meso．tartaric meso一酒石酸(meso．tartaric acid，内消旋酒石酸)在盐业、膜电解等方面具 有重要的用途。meso一酒石酸主要是由反式环氧琥珀酸水解酶(TESH)水解底物 反式环氧琥珀酸而得。迄今已见的关于meso一酒石酸生物转化技术的报道仅限于 野生菌筛选和发酵工艺研究，其TESH酶活低目酶稳定性差。因此，获得高活力 和高稳定性的TESH酶及其高效活性表达菌株对于工业化应用具有重要的意义。 本文从土壤中筛选到—株可产TESH的野生菌，经形态学观察、生理生化试 验以及16S rDNA序列比对鉴定为韩国假单胞菌．命名为Pseudomonas koreensis BK-9。利用硫酸铵沉淀、阴离子柱层析和疏水柱层析技术，从Pseudomonas koreensis BK-9中分离得到纯的TESH酶。经蛋白质质谱检测，其分子量为32．25 kDa。该TESH在温度小于40。C、pH 3．5-11时比较稳定。该TESH不是金属离 子依赖型酶，对反式环氧琥珀酸的动力学参数‰和％。分别为8．22 4-0．2 mM 和2．5 4-0．1 mM／min。 在测得该TESH酶末端序列的基础上嘏十引物魔隆得到TESH编码基因， 并在大肠杆菌中实现高效活性表达。该基因工程菌在5 L发酵罐中最高酶活可达 到35542 U／g，是—株适合进行工!l匕化生产meso一酒石酸的菌株。 关键词：meso．酒石酸：反式环氧琥珀酸水解酶；纯化；克隆：表达：发酵：大 肠杆菌：韩国假单胞菌 Ⅲ 万方数据 AbstractMeso-tartaric Abstract Meso-tartaric acid is mainly applied in salt industry and membrane elect