不同中医治法抗急性心肌缺血的作用及机理研究中医内科学专业论文.docxVIP

法)的相应代表方：血府逐瘀汤、瓜萎薤自半夏汤、冠一心苏合胶囊分别作用于垂体 法)的相应代表方：血府逐瘀汤、瓜萎薤自半夏汤、冠一心苏合胶囊分别作用于垂体 后叶素(Pit)所致的急性心肌缺血的大鼠模型，观察这三种方药对pit致急性心肌 缺血大鼠的血浆ET、一t5肌组织eNOs的mRNA表达以及大鼠心电图的影响，从而 推导心痛发作期的三种不同治法通过抵抗冠状动脉痉挛，保护、改善心肌组织的血 液循环等途径对抗急性心肌缺血的机理。 (1)垂体后叶素(Pit)致大鼠急性心肌缺血模型的建立 用于实验造模的Pit剂量的确定：用不同剂量的Pit给予大鼠尾静脉注射，然后记 录、观察大鼠心电图的变化，以心电图sT段上移O．1mv以上，可确定为大鼠心肌 缺血的心电图诊断。 (2)分别用血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊的制剂给予体重180～2209 的SD大鼠灌胃，连续7天。然后在麻醉状态下用Pit给予大鼠尾静脉注射，造成大 鼠急性一11,Jvt缺血。随后，记录注射Pit后15s～10min时间段大鼠的心电图变化。 (3)心脏取血，分离血清，用放免法检测大鼠血浆ET的含量，RT-PCR法检测心肌 组织eNOs的mRNA表达。 2、心痛发作期不同治法对急性心肌缺血大鼠心肌组织的凋亡相关基因bcl-2、bax 的rnRNA表达的影响 实验大鼠经用上述方法灌胃和注射Pit后，开胸取心脏，选取心尖部心肌组织， 用RT-PCR方法检测凋亡相关基因Bcl．2、Bax的mRNA表达，并计算bcl一2／bax的比 值。 3、心痛发作期不同治法对新生大鼠离体心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用 通过研究，11,痛发作期的三种常用治法(活血祛瘀法、通阳豁痰法和芳香温通法)的 代表方一血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊的含药血清对新生大鼠离体，11, 肌细胞缺氧／复氧损伤后细胞生存率、细胞凋亡率、细胞MDA含量、乳酸脱氢酶 (LIDH)活性等的干预作用，从而推导心痛发作期的三种不同治法对心肌细胞缺氧／ 复氧损伤的保护作用。 (1)培养原代新生大鼠心肌细胞：取3～5天龄的Wistar系大白鼠乳鼠，开胸取心尖 部心肌组织，经O．06％胰蛋白酶液消化，收集消化液，离心，弃去上清液。沉淀加入 含20％d、牛血清的1640培养液制作细胞悬液，采用差速贴壁分离法纯化心肌细胞。 经200目无菌不锈钢网过滤，重新接种在培养瓶中，放入二氧化碳培养箱(37。C，5％C02) 中进行培养。培养5～7天的大鼠心肌细胞用于实验。 (2)建立大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型：将生长良好的大鼠心肌细胞的培养基倒掉， 用纯氮气(99．99％)饱和的缺氧培养基冲洗，再取缺氧培养基加入培养瓶中，同时向瓶 内充氮气10秒钟以置换瓶内空气，紧闭瓶塞，置于37℃温度下培养4h为缺氧。然后 用经过95％02和5％C02混合气体饱和的模拟再灌注培养基置换缺氧培养基，嚣于 37℃，5％C02培养箱中孵育2h为复氧。用MTT法测定缺氧／复氧前后心肌细胞的生 II 存率以及测定缺氧／复氧前后心肌细胞的MDA含量和细胞上清液的LDH含量，检测 存率以及测定缺氧／复氧前后心肌细胞的MDA含量和细胞上清液的LDH含量，检测 造模是否成功。 (3)制备含药血清：分别用血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤、冠心苏合胶囊的药物制 剂给予大鼠灌胃，连续3天，最后一次灌胃后50min，进行大鼠心脏取血，离心，分 离血清。血清经灭活后置于一80℃冰箱中保存待用。 (4)用MTT法确定用于干预大鼠心肌细胞缺氧一复氧的药物血清浓度。 (5)各实验组的大鼠心肌细胞，先用经过实验(4)确定浓度的含药血清，预处理3h， 然后进行缺氧4h，复氧2h。 (6)用全自动生化仪检测各组心肌细胞的MDA含量及LDH的活性。 (7)取上述缺氧一复氧后的心肌细胞，用MTT法检测各组心肌细胞的生存率。 (8)用Hn咂L法，检测心肌细胞凋亡率：取缺氧一复氧后的各组心肌细胞，用4％ 多聚甲醛溶液固定，接着进行内源性过氧化物酶的阻断和细胞的通透，然后滴加 TUNEL反应混合溶液进行标记，荧光显微镜下分析结果，并计算细胞凋亡指数。 三、研究结果 1．建立了本研究的垂体后叶素(Pit)致大鼠急性心肌缺血的模型，经过心电图的 检测和统计学的分析，说明造模成功。确定了用于造模的Pit实际剂量为1．5u／kg(大 鼠尾静脉注射)，并且于注射后30s～10rain时间内出现典型的心肌缺血的心电图，表 现为ST段抬高，心律失常、甚至伴有0波的出现等。 2．心痛发作期三种不同治法相应的代表方对Pit致急性心肌缺血大鼠的心电图有明 显的改善作用。在高剂量时，活血祛瘀法作用效应最强。低剂量时，芳香温通法作用 效应最强，其次为活血祛瘀法，再次为通阳豁痰法。 3．心痛发作期的三种不同治法均可通过降低