dev基因文库构建核衣壳蛋白基因的发现及克隆与表达预防兽医学专业论文.docxVIP

文刈 文刈 四川农业大学博上学位论文 和VPl l(32kD)，其中VPl、VP2、VP3、VP6、VP8和VP9等六条区带的蛋白含量之 和rLl‘整个蛋白总量的89．04％，为DEV的主要结构多肽。 2．对DEV CHv株基因组DNA进行了限制性核酸内切酶分析：通过DEF增殖 DEV CHv株后，比较了两种方法对DEV基因组DNA的提取效果，结果发现：从病 毒感染细胞中直接提取病毒基因组，其含量较高，但纯度低，而经初步提纯病毒后再 提取其基因组DNA，其含量有所降低，但纯度较高；用BamH I、B∥11、EcoRV、 HindIII、Km I、Pst I、Sal I、Xba I和Xho I等9种内切酶对DEVCHv株基因组 DNA进行酶切消化，结果分别产生12、15、12、9、14、15、12、15和13条核酸片 段，其分予量和为102．4 kb～153．1 kb；将其中三种酶的酶切片段与国内外其它DEV 毒株相比较，发现它们在酶切片段条数及其分子量大小、总和等方面均存在一定差异。 3．构建了DEV基因文库，发现了DEV核衣壳蛋白基因并进行了克隆与鉴定： 通过提取DEV基因组DNA，超声波处理使其片段化，经T4 POL补平末端后，采用 SMART cDNA Library Construction Kit进行分级分离，收集各部DNA片段，与质粒 pBluescript II SK。连接，转化DH5a感受态细胞，通过蓝白菌落筛选，挑取白色重组 菌落进行测序，从而得到了DEV基因文库；将其中一个含完整ORF的DNA片段， 以BLASTX软件与GeneBank上相应基因进行比对分析，初步确定为一种核衣壳蛋白 基因；根据该片段序列，设计引物对DEV DNA进行PCR扩增，并克隆到pGEM．T 载体上，转化宿主菌JMl09，提取阳性重组质粒，经PCR鉴定、测序及生物信息学 分析，确定该片段为DEV核衣壳蛋白基因。 4．建立了一种针对DEV核衣壳蛋白基因的PCR检测方法：利用针对DE_v核敖 壳蛋白基因的一对引物(扩增跨度为1013bp，含完整的DEV衣壳蛋白基因)对DEV强 毒CHv株和弱毒CHa株基因组DNA进行扩增，获得了与预期大小相符合的特异性 条带，成功建立了检测DEV衣壳蛋白基因的PCR方法；应用该方法对正常DEF细 胞、尿囊液及其它病原体(鸭病毒性肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭沙门氏杆菌、鸭 大肠杆菌、鸭疫罩默氏杆菌及小鹅瘟病毒)的核酸提取物均不能扩增不出任何条带； 而对DEV基因组DNA，其灵敏度可达到lpg；对DEV感染的32份临床病料进行检 测，均能扩增出与预期大小一致的特异性条带。这些结果表明，该PCR法具有特异 性强、灵敏度高、简便快速等优点，可作为临床上DVE的一种诊断和检测方法。 5．成功构建了DEV核衣壳蛋白基冈的原核表达载体：以含DEV CHv株核衣壳 II 中文摘要蛋白基因的克隆载体pGEM-NP为材料，采用Oligo软件设计 中文摘要 蛋白基因的克隆载体pGEM-NP为材料，采用Oligo软件设计 对特异引物，以高保 龚Taq酶扩壤窭含整个孩衣壳茧皇基因的DNA片段(820bp)，缀BamHI霹HindlII双 酶切后，从胶上回收目的基因，与经过相同两种内切酶处理纳原核表达载体pET32a 连接，转化大肠杆菌Dtl5a感受态细胞，然后提取质粒，经PCR和BamttI／HindlII 双酶凌验涯，表骥己残功将DEV拔农壳蛋叁摹觳宪建裂磊竣表达载髂上，铁霆梅建 了DEV核农壳蛋白基圆的原核表达藤粒(重组质粒命名为pET32．NP)。 6．利用大肠杆菌作为表达宿主，对DEV核衣壳蛋白基因进行了表达研究，并分 氍了萁表达产耪豹抗藤靛：获E．coti DH5a孛提敬l萋整覆粒pET32一NP，采溺CaCl2 法转化至表达宿主菌BL21(DE3)中：先使用小剂量筒液在IPTG诱导下，重组质粒表 达的蛋白带出现在48kD处，与预期袋达蛋白的分子量大小(约为28kD)基本榴苻；对 不嚣诱导时溺及诱导蠢《浓度等条俘遴{亍优化后，镶宠重缰质稳pET32-NP静羧{睾诱导 条件为O．4mmol／LIPTG、37 4C诱导3 h；经SDS．PAGE电泳分析，表达的重组拦白约 占菌体总鬣自量的21．S％，其中可浴性秘包涵体形式分别约占熬缀蛋白总量的43％帮 57％；逶造Western—Blotting手l ELISA证实，表达豹重缝蛋幺具骞蘸好懿抗凝缝。 关键词：鸭病毒性肠炎病毒；基因缀DNA：限制性核酸内切酶分析；基因文库：核 袤壳蛋自基囡；梅建；表达；挠磊往 Ill 苎塑 苎塑 婴型查些查兰堡±兰垡堡茎