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/e1010170 DOI:10.21769/BioProtoc.1010170 活性氧检测 Reactive Oxygen Detection 游均，方玉洁，熊立仲* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：lizhongx@ 引用格式 ：游均，方玉洁，熊立仲 . (2018). 活性氧检测 . Bio-101 e1010170. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010170. How to cite: You, J., Fang, Y. J. and Xiong, L. Z. (2018). Reactive oxygen detection. Bio- 101 e1010170. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010170. (in Chinese) 第一部分：NBT染色检测超氧阴离子(O2-) 实验原理：氮蓝四唑 (NBT, nitroblue tetrazolium) 与超氧阴离子发生反应并形成蓝色的 甲臢 (formazan)。 实验目的：定性、原位检测水稻各组织中的超氧阴离子(O2-)。 关键词：活性氧，氮蓝四唑，超氧阴离子，水稻，生理指标 材料与试剂 1. 50 ml离心管 2. 10 ml离心管 3. 氮蓝四唑NBT (Sigma, USA, CAS: N5514) 4. 叠氮化钠 (Sigma, USA, CAS: S8032) 5. 1 M 磷酸缓冲液 (pH 7.8) 6. 95% 乙醇 7. 1 M叠氮化钠溶液 (见溶液配方) 8. NBT染液 (见溶液配方) 仪器设备 1. 真空干燥箱 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010170 DOI:10.21769/BioProtoc.1010170 2. 水浴锅 实验步骤 1. 配制NBT染液(见溶液配方)并分装入50 ml离心管。 2. 用剪刀剪取水稻叶片或其他组织，立刻放入装有NBT染液的50 ml离心管中。 3. 将离心管放入真空干燥箱内，打开管盖。关闭真空干燥箱门和排气口，打开真空 泵抽出箱内空气，待负压表读数降至-0.1 MPa时关闭真空泵，保持负压30 min 。 4. 打开排气口，恢复箱内气压，待气压稳定后取出离心管，于室温(25 °C)静置60 min。 5. 倒弃NBT染液，加入95%乙醇并浸没样品，将离心管置于80 °C水浴中脱色，每隔 10min换一次95%乙醇，待样品的绿色全部褪去后将样品取出拍照记录染色结果。 溶液配方 1. 1 M叠氮化钠溶液 称取0.6501 g叠氮化钠固体于10 ml离心管中，加入ddH O定容至10 ml 2 2. NBT染液 称取0.05 g NBT于50 ml离心管中，加入500 μl 1 M叠氮化钠溶液和500 μl 1 M 磷酸缓冲液(pH 7.8)，加入ddH2O定容至50 ml 第二部分：DAB 染色检测过氧化氢 实验原理：当过氧化物酶存在时，二氨基联苯胺 (3,3’-diaminobenzidine, DAB) 被双 氧水氧化生成不溶于水的暗棕色颗粒。 实验目的：定性、原位检测水稻各组织中的双氧水。 关键词：水稻，生理指标，活性氧，过氧化氢，二氨基联苯胺 材料与试剂 1. DAB (Sigma, USA, CAS: D8001) 2. 95% 乙醇 3. 0.2 M HCl Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010170 DOI:10.21769/BioProtoc.1010170 4. DAB 染液 (见溶液配方) 仪器设备 1. 真空干燥箱 2. 水浴锅 实验步骤 1. 配制DAB 染