斑马鱼免疫相关基因研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

张广献 张广献 巾山大学博士学位论文 摘要 作为一种模式生物，斑马鱼被广泛应用于发育生物学、分子生物学、遗传学、 毒理学、病理学及免疫学等领域的研究。本文通过建立金黄色葡萄球菌感染前后 的斑马鱼淋巴绌胞cDNA文库和探索斑马鱼基因打靶技术来研究斑马值的免疫。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus oblreas)是临床上一种常见的引起炎症反应 的病原微生物，我们通过两次腹腔注射感染斑马鱼，建立了s aUFeUS．斑马鱼感 染模型，从而为研究置aureus的致病机理和探索斑马鱼免疫防御机制打下了基 础。用传统的Ficoll—Paque Plus试剂，从斑马鱼全血中分离出高纯度的淋巴细胞， 应用SMARTT”cDNA Library Construction技术，构建以真核表达载体pcDNA3 为基础的cDNA表达文库。对于正常的斑马鱼淋巴细胞eDNA文库(Drlym)已 测得4261 ESTs序列并拼接成2742clusters，对于aurells感染的斑马鱼淋巴绌 胞eDNA文库(Driflym)已测得6988 ESTs序列并拼接成5334 clusters。通过对 感染前后文库中与免疫应答或抗感染信号途径有关的序列及与其它高等脊椎动 物(小鼠和人)比较表明，斑马鱼的免疫应答和抗感染机制与小鼠及人有较高的 保守性。比如存斑马鱼Driflym文库中发现IL-10受体、TNF及其受体和CD40 等分子相应高表达，显示了在斑马鱼中也可能同样存在完整的IL-IO抗感染信号 通路。另外，在Driflym中还发现了一系列CD分予的高表达，其rr『的一些还是 首次在斑马鱼中发现，如CD2、CD9、CDl8、CD53、CD40及CD84等。通过 对感染前后两个文库的比较表明，s aureus有能力激活斑马鱼淋巴细胞的增殖、 分化和启动‘些相关基因的表达。 在对两个cDNA文库的ESTs序列分析中，分别发现了两个新的免疫型受体 基因(Novel immune．type receptor,nitr)，分别命名为nitrl3(Drlym)和nitrl4 (Driflym)。nitrl3定位于斑马鱼第22号染色体h含有3个外显子和2个内含 子，通过Blast对斑马鱼基因组的搜索及用Genscan对其基因组序列的分析结果 表明，在nitrl3的5’端上游还存在4个与nitrl3的IGv结构域(domain)高度 同源的编码IGv序列(V1、V2、V3和V4)，但其中的V4发生了琥珀(TAG) 突变捉|jif终I J：了。在nitrl3的3’端下游电存在2个编码1Gv序列(V6和VT)。 把这7个IGv序列建立系统发生树，分析结果表明，它们来自同一个祖基因的两 张广献 张广献 I卜山犬学博I学位论文 次复制。通过Southern杂交结果分析表明，nitrl3在基因组里只有一个分子拷贝 (copy)，Northern杂交结果表明在受榆测的各组织中都有表达，只是表达水平 有差异，在鳃里有较高表达。|一J样，nitrl4通过与斑马鱼基蹦组的比埘，被定位 于第16号和第14号染色体上，具有4个分子拷贝，与Southern杂交结果一致。 Northern杂交结果表明NITRl4在斑马鱼鳃中表达水平最高，在肾、肠和脾脏中 也有较高表达，在精巢和心脏中表达水平较低，而在其他样品组织中没能检测到 表达，表明NITRl3和N1TRl4可能参与先天性免疫反应。 另外，本文还探讨了利用斑马鱼单胞期(1-cell)受精卵为直接基因打靶(Gene targeting)载体注射材料，再加上两种荧光蛋白(EGFP／DsRFP)作为』F负筛选 标记，探索出一种在斑马鱼中成功进行基因打靶的技术方法。考虑到可行性和基 冈研究背景等因素，我们选择了用斑马鱼B-actin启动子序列置换斑马鱼生长激 素(Growthhormone，GH)启动子序列。为此构建了两个打靶载体pGHTl．7k和 pGHT2．8k，并对它们分别显微注射斑马鱼受精卵。在实验中还发现虽然 pGHT2．8k的阳性率比pGHTl．7k稍高，但其致死率也较高。利用绿色荧光和红 色荧光蛋白作为筛选标记，挑出只发绿色荧光的胚胎并养到成鱼后使其与野生型 斑马鱼杂交，从而筛选出绿色荧光标池的F1代，大约有2．5％的PO代可以遗传 绿色荧光蛋白，再对F1代进行Southern杂交进一步鉴定。PO代不能遗传绿色荧 光蛋白的PO代也用PCR和Southern杂交分析。最终统计的阳性打靶结果为 1．7E．6。 总之，我们的结果显示在结构和功能上斑马鱼的免疫系统和调控机制和其他 高等脊椎动物相比具有高度的保守性，是一个用于研究先天性和后天性免疫系统 的良好的模型。通过埘斑马鱼GH启动子置换的实验结果表明，双荧光筛选策略 在斑马