豆薯种子病程相关蛋白spe16的性质和结构研究细胞凋亡关联蛋白alg2的初步晶体学研究生化和分子生物学专业论文.docxVIP

致谢1999年9月我7i仁进入了中国科学技术大学生命科学学院蛋白质晶体学实 致谢 1999年9月我7i仁进入了中国科学技术大学生命科学学院蛋白质晶体学实 验室，在龚为民教授的悉心指导下从事结构生物学的研究。龚为民教授认真严谨、 一丝不苟、精益求精的科研作风：自由、开放的科研精神；坦诚无私的胸怀，深 深的影响着我。他不仪}；有渊博丰富的理论知识和试验经验，而且不断的为学生 创造更好的试验条件，jF积极营造实验室团结、活跃的科研气氛给我留下了深刻 的印象。非常感谢龚为K教授在试验工作上给予的关怀和帮助，教会了我很多科 研和为人方面的道理，¨我终身受益。 感谢黄庆秋老师m我刚刚接触生物学试验时教会我蛋白纯化和晶体生长的 试验技术。感谢李一琨老师对我在分子生物学试验技术上的指导和帮助。感谢魏 志毅同学帮助我觯决J’结构解析中的难题。感谢张敏老师和王艳丽对我生活上的 关心和精神上的支持，、感国t严明协助我完成了本论文的部分工作。 还要感谢实验暑i所订其他同学和老师，是他们给了我一个团结、温馨的工 作环境，使我始终处J：良好的生活和学习氛围中。他们是：王芳，常少杰，周召 才，宋晓敏，刘琳，力懋，程中军，张平，薛妍妍，余聪，徐峰峰，王字，陈骞． 刘寒剑，周丹，周小川，陈志锋，石玎玎，鲁善翔。李妍，姜晓华，王杨，宋敏， 李旭，王静，卞辽等． 最后要感谢我的父母和家人，他们的理解和支持使本论文的研究工作得以 顺利完成。 中国科学技术大学博士学生iL-走 中国科学技术大学博士学生iL-走 第一荨分豆薯种子痛程相关蚤I身$FEl6的性质和黠梅研究 中国科学技术赶学生命科学院中国科学院结构生物学开放实验室是芳 第一部分豆薯种子病程相关蛋白SPEl6的性质和结构研究 摘 要 SPEl5是我们在，l二藩(P盆chyrrhizvs@POll9)种子中新发现的一个单体分子量为 16kDa的蛋白。纯化的蛋白经N端氨基酸序列分析显示其与植物病程相关蛋白第十家 族PR-IO具有很高的旧源性。根据N端氨基酸序列及PR—lO家族蛋白c端保守序列设 计了两个简并引物．通过RT-PCR和3’ful】RACE的方法得到了编码这一蛋白的全长 eDNA序列，证实了”}’16是病程相关蛋白PR-IO的新成员。将此基因克隆到pETl5b 质粒上并在大肠杆胬t{1得到表达。活性实验显示。天然和重组的SPEt6蛋白都具有明 显的类核糖核酸酶活‘降。我们针对可能参与这种SPEl6的类核糖核酸酶活往的三个氨 基酸E95、E147、Y11q和‘个P一100p分别构建了定点突变和缺失突变体。结果发现 P—loop和结构l：位1io端q螺旋两侧且高度保守的(；lul47，Tyrl49是与其RNase的 活性相关的。我们还发现天然SPEl6蛋白有结台非极性的荧光探针分子8一苯氮一卜萘 磺酸(ANS)的功能。通过气象悬滴扩散的结晶方法我们得到了不同形式的SPEl6蛋白 晶体，包括天然”¨6货臼晶体(SPEl6Nr))，SPEi6和ASS共结晶的复合物晶体 (SPEl6(+ANS))。这¨种彤式的蛋白晶体都收集到了较高质量的数据．并且都已用分 子置换方法得斟相住。l§榻已经解柝完毕。汀￡16晶体一个独立区韵两个分子通过c 末端a螺旋之间的疏水相互作用形成二聚体。结构模型的总体特征是七个反向平行 的B折叠片和＼端阳个小旺螺旋包裹着C末端一个长的a螺旋，并且这3个c【螺旋 以及B折叠形成了’分Y型疏水空穴。sPEl6(+AXS)复合物的结构显示存在于SPEl6 结构中的Y型疏水空穴和分子表面的疏水区有结合非极性分子的功能，显示SPEl6蛋 白除了RNase酶活性以外的结合功能。鉴于PR-tO蛋白家族的真正功能还没有确定， 我们的这些试验结果为揭示这个家族蛋白真正生物学功能提供了新的证据。 关键词：SPEl6，突变体，RNase酶活性，SPEl6结构 中国科学技术大擘博士学位论t 中国科学技术大擘博士学位论t 第一部分豆薯种子病程相关蛋白SPEl6的一I主质和结构研究 中国科学技术七学生命科学院中国科学院结构生物学开放实验室昊芳 Abstract SPE．16 iS new 16 KDa protein that has been purified from the seeds ofPachyrrhizus erosits．Its N-term amino acid sequence shows significant sequence homology pathogenesis-related class 1 0 proteins．eDNA encoding 1 50 amino acids was cloned by RT-PCR and the gene sequence proved SPE一1