蝙蝠葛酚性碱对泌尿系统肿瘤作用的实验研究外科学专业论文.docxVIP

中文摘要1．采用三步法对北豆根醇提物进行初步纯化，提纯北豆根有效成分 中文摘要 1．采用三步法对北豆根醇提物进行初步纯化，提纯北豆根有效成分 PAMD。通过薄层板显色观测PAMD主要含有的生物碱成分。对PA。MD 通过柱层析进一步分离纯化，，得到纯品生物碱晶体，应用薄层层析、电喷 雾质谱以及紫外分光光度计进行成分鉴定。 2．用MTT法分析将其有效成分PA№及其纯品Dau作用于膀胱癌 T-24细胞株、肾癌细胞株786．O、前列腺癌PC．3细胞株及肾癌和膀胱癌 原代培养细胞，观察抑瘤效果，计算药物的半数抑制浓度(IC50)。 ■ 结果： 1．PAMD的主要成分是为Dau和DS，分子量分别为624KD及 610KD。 2．本实验显示，Dau及即山D均能对不同的泌尿系统主要的肿瘤有 体外显著的增殖抑制作用。最低的敏感药物浓度多在3．75弘咖l，抑制率 随药物浓度及作用时间而增加。Dau对T．24、786．O及PC．3肿瘤细胞株 增殖作用IC50分别为5．1}lg／ml、5．8pg／ml及8．1pg／瑚，而鼢山∞对三组 的IC50分别为13．3“∥ml、16．6“咖l、19．2“咖l。Dau对各组细胞的增 殖抑制强度高于鼢山∞组，在IC50对应的浓度上，PAMD组是Dau的 2．5．3倍，说明Dau是始ⅣD中起作用的有效成分之一。按照判定标准， 本样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。并且从IC50分析，T．24、786．O 及PC．3肿瘤细胞株对Dau和P舳的IC50依次递增，即对药物的敏感 性依次下降。 3．Dau对原代细胞肾癌和膀胱癌细胞也有不同程度的抑制作用， 但抑制率较相应的肿瘤细胞株降低，IC50在3．75pg／ml到60p咖l以上 不等，差异较细胞株组为大。在有效剂量内(IC50lO鹇／m1)，ll例中5例 对药物敏感。 一 结论：北豆根的有效成分是W山回，最终提纯品为Dau和蝙蝠葛苏林 碱(dauris01iIle，DS)。P触ⅥD和Dau对多种泌尿系统常见的肿瘤细胞株 有很强的体外增殖抑制作用，且呈浓度和时间依赖性，说明此类生物碱 具有广谱的抗肿瘤作用；T。24、786一O及PC．3肿瘤细胞株对Dau和PAⅣ皿的 敏感性依次降低。与PAMD相比，纯品Dau的抑瘤作用更为有效，提示Dau 是鼢山D的有效成分之一；Dau对原代肿瘤培养细胞也有不同程度的抑 制作用，但抑制率的差异较大，提示不同个体的肿瘤的异质特性使 中文摘要对药物的敏感性产生差异。 中文摘要 对药物的敏感性产生差异。 第二部分Dau诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究 目的：探讨Dau对人膀胱癌T一24细胞株诱导凋亡的作用，并初步阐 述其抗肿瘤机制。 方法：采用流式细胞技术、荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳及透射电镜 等技术测定和观察Dau对诱导肿瘤细胞凋亡的影响。 1．荧光染色实验调节对数生长期的T．24细胞浓度为l×105个／m1， 与30灶咖l和O¨咖l的Dau作用，染色后用×400荧光显微镜进行凋亡形 态学观察。 2．电镜观察取5×106／“的T．24细胞悬液，加入终浓度为39蚓ml 和5p咖l的Dau，另设空白对照组，于透射电镜下观察凋亡细胞的超微 结构变化。 3．流式细胞仪分析调节肿瘤细胞浓度为1×105个／ml，与30U幽11l、 5肛g／ml、l肛g／ml和O“酌nl的Dau于370C培养24 h、48h和72h，收集细 胞，上机检测。 4．用流式细胞仪测定了Dau处理T-24细胞72h后的以及未处理细胞 的bcl．2和baX基因的蛋白表达量。 5．DNA提取及琼脂糖凝胶电泳取对数生长期细胞，经用药培养， 在1．5％琼脂糖凝胶上电泳4h。离心，染色，紫外光下观察并摄影。 结果： 1．T．24细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡特征性梯形条带。 2．电镜显示，Dau作用于人膀胱癌T-24细胞株后，可见胞体缩小，胞 质浓缩．，胞核向外呈锐角突起，染色质浓缩，密度增高，边集于核膜下或 呈新月形，核固缩，电子密度增高等。 3．荧光显微镜细胞形态学观察A0／EB染色后，30p咖l Dau处理 48h的人膀胱移行细胞癌细胞株T．24呈现出凋亡细胞形态：早期凋亡细 胞多为圆形，细胞膜较粗糙，呈绿色，细胞核中有鲜绿色的斑点；晚期凋 亡细胞形状不规则，细胞膜粗糙，有较多突起，体积缩小，胞质浓缩，胞 核DNA发出橙色荧光，胞核边缘不规则，出现核固缩、核碎裂等，呈大 小不等、形态不规则的碎片状，细胞中有鲜亮的橙色斑点。 4．流式细胞分析，DNA直方图上可见G1期峰前显现明显的细胞凋亡 中文摘要 中文摘要 峰亚Gl期峰。凋亡率随药物浓度和作用时间而增加，高浓度30“咖l的 Dau处理72小时的凋亡率为32．72％。经流式细胞仪分析， 30u酌nl Dau 处理72h的人膀胱移行细胞癌细胞