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水飞蓟发状根培养体系建立和其水飞蓟宾含量测定 ［摘要］实验采用6种发根农杆菌R1601, R15834, R1000, A4, R1025, R1感染水飞蓟植体，诱导水飞蓟发状根 及其水飞蓟宾的产生。6种发根农杆菌均能诱导水飞蓟产生 发状根，A4表现出较强的对水飞蓟的感染能力。实验通过 侵染时间、预培养、共培养、pH等因素确定了诱导水飞蓟发 状根产生的条件，确定MS液体培养基适合水飞蓟发状根的 增殖。经过PCR分子鉴定，发根农杆菌中的DNA质粒成功的 整合到转化根的基因组中。使用液相色谱测定了水飞蓟发状 根中水飞蓟宾含量是水飞蓟植物中的2. 5倍。实验所建立的 水飞蓟发状根培养系统，为研究水飞蓟发状根大量培养生产 水飞蓟宾奠定了基础。 ［关键词］水飞蓟；发根农杆菌；发状根；水飞蓟宾 ［收稿日期］2013-11-13 ［通信作者］杨世海，Tel: (0431) E-mail： jlyangs@163. com ［作者简介］张淑丽，硕士研究生，E-ma订： littlepighappy@qq. com 水飞蓟 Silybum marianum (L. ) Gaertn 别名水飞雉、 乳蓟、老鼠筋、如蓟子，原产于南欧及北非，属于菊科水飞 蓟属植物，干燥成熟的果实入药。瘦果呈长倒卵形或椭圆形, 长5?7 mm,宽2?3 mmo表面淡灰棕色至黑褐色，光滑， 有细纵花纹；顶端钝圆，稍宽，有一圆环；中间具点状花柱 残迹；基部略窄，质坚硬。破开后可见子叶2片，浅黄白色, 富油性，气微，味淡［1］。水飞蓟种子和水飞蓟植物中含有 水飞蓟素，水飞蓟素具有抗肝中毒、保护肝细胞膜、改善肝 功能的药理活性，临床用于治疗肝炎、胆囊炎等［2］,主要 成分为水飞蓟宾。近年来水飞蓟素又扩展应用到抗衰老和美 容化妆品领域［3］；随着研究的深入，水飞蓟素在癌症的治 疗中也发挥着越来越重要的作用［4-5］,市场需求巨大。 利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes诱导药用 植物产生发状根，寻求建立适合生产次生代谢产物的培养系 统，已成为药用植物培养系统的一个研究热点。与传统的细 胞培养技术相比，发状根具有遗传稳定、生长迅速、合成次 生代谢物质能力强且稳定及向培养液释放部分代谢产物等 优点，是生产次生代谢产物较理想的组织［6］。 本研究利用发根农杆菌R1601, R15834, R1000, A4, R1025, R1诱导水飞蓟组织产生发状根，建立水飞蓟发状根 离体生长的培养体系，为发酵法扩大培养提供可行性动力学 参数，同时也为药用植物水飞蓟提供一条可持续性利用的新 途径。 1材料与方法 1.1水飞蓟无菌苗的培养 供试水飞蓟S. marianum种子采自吉林农业大学药植 园，经吉林农业大学中药材学院杨世海教授鉴定。挑选当年 成熟干燥的水飞蓟种子，温水浸泡60 min后，在生物洁净 工作台内用无菌水清洗3次；75%乙醇浸泡30 s,无菌水清 洗3遍，每次清洗30 s；然后再用0. l%HgC12浸泡10 min , 无菌水再次清洗5?6次，每次清洗2?3 min。最后用灭菌 滤纸将种子表面的水分吸干，用镀子轻轻放置在装有MS固 体培养基（不添加任何激素）中，置于温度为24?25 °C. 光强2 000 lx、光照12 h ? dT、黑暗12 h ? d~l的条件下 交替培养，等待萌发无菌水飞蓟幼苗，作为遗传转化用的外 植体。 1. 2发根农杆菌的活化 发根农杆菌菌株 Agrobacterium rhizogenes R1601, R15834, R1000, A4, R1025, R1,由中国农业微生物研究所 菌种保藏中心提供。在无菌条件下，用接种针挑取保存菌液, 于YEB固体平板上划线培养，放置于28 暗培养条件下培 养，直到长出单菌落。挑取1个单克隆菌落接种于装有加有 Kan的20 mL YEB液体培养基中，28 °C恒温摇床，180 r ? min-1条件下培养24 h,将农杆菌复苏。将已复苏的菌液取 出1 mL加入装有50 mL YEB液体培养基的锥形瓶中，恒温 摇床 28 °C, 180 r ? min-1 再次培养 12 h, A600 为 0. 4 时 进行侵染。 1.3水飞蓟发状根的诱导 在无菌条件下将水飞蓟无菌苗的幼嫩叶片剪成0.5 cm2 大小的片段，根、茎段、叶片分别剪成长约0. 5 cm和0.5 cm2 的小段和叶片。每个样品在MS0 （不添加任何激素）固体培 养基上接种10片（段），并且每个样品均做3次平行，黑暗 中26 ￡下预培养36 ho在超净工作台内，将预培养的外植 体（根段、茎段、叶片）转移至活化好的发根农杆菌菌液中， 侵染。在侵染过程中，轻轻地摇晃锥形瓶，4 min后用无菌 滤纸吸干表面菌液，