toll样受体4内源性配体对肝星状细胞生物学活性的影响的研究消化内科学专业论文.docxVIP

To Toll 样受体4 内源性配体对肝星状细胞 生物学活性的影响的研究 中 山医 院 消化 内科 学 研 究 方 向 肝 纤 维 化 指 导 教 师 郭津生 副教授 导 师 组 成 员 林成招 助理研究员 目 目 录 中 文 摘 要 1 英 文 摘 要 3 B !J s 5 第 一 部 分 H M G B 1 对 肝 星 状 细 胞 T L R 4 介 导 的 炎 症 信 号 途 径 的 影 响 ■ ■ 施 8 实 验 结 果 17 讨 论 2 3 第 二 部 分 H M G B 1 对 肝 星 状 细 胞 纤 维 化 发 生 活 性 的影 响 材 料 和 方 法 2 4 实 验 结 果 2 8 舰 32 过 齡 3 3 3 4 附 录 综 述 1: 肝 星 状 细 胞 的 起 源 与 功 能 综 述 2 :H M G B 1 的 研 究 进 展 英 汉 缩 略语 名 词 对 照 表 致 谢 7 T ol T oll样 受 体 4 内源 性 配 体 对 肝 星 状 细 胞 生 物 学 活 性 的影 响 的研 究 中文 摘 要 背景及 目的：星状细胞 (H epatic stellate cell, H SC ) 是纤维化发生时肝脏细 胞 外 基 质 (ex tracellular m atrix , E C M ) 的 主 要 来 源 。T o ll 样 受 体 4 (T oll lik e receptor 4 , T L R 4 ) 是哺乳动物跨膜模式识别受体家族的重要成员，能识别细 菌脂多糖 （lipopolysaccharide, L PS ) 并介导炎症反应和天然免疫，此外还能 识别一些损伤相关 内源性配体 如高迁移率族蛋 白 l(H igh m obility group box-1 protein , H M G B 1)。近年发现 H SC 具有完整的 T LR 4 信号并对 L PS 具有反应 性 。本 实验 旨在 探 讨 H M G B 1 对 H S C T L R 4 信 号 途 径 的激 活 作 用 及 对 其 细 胞 生 物 学 活 性 的 影 响 。 方法：1.复苏培养永生化小鼠野生型（W T)、TLR4基因敲除(TLR4V)、M yD88 基因敲除(M yD88_A)肝星状细胞株JS1、JS2、JS3,计数并接利于细胞培养板， 每种细胞分为对照组 、L P S 处理组 (100ng/m l)、H M G B 1 处理组 （100ng/m l)。 采用 荧光酶标记 的转录 因子 N F -kB (N F-kB -1uc)或 A P -l(A P -l-luc)反应性报告 质 粒 与 内参 质 粒 （R -L u c ) 用 脂 质 体 介 导 共 转 染 三 种 细 胞 系 ，检 测 H M G B 1、 L P S 处 理 后 细 胞 N F -kB 及 A P -1 的活 性 ；另釆 用 逆 转 录 -实 时 定 量 P C R 法 (RT-qPC R ) 检测各组处理细胞单核细胞趋化蛋 白 （M onocyte chem otactic protein-1, M C P-1) 的 m R N A 的表达; E LISA 法检测细胞上清 中 M C P-1 的蛋 白分 泌 。2 . 将 JS 1 、JS 2 、JS 3 分 别 接 种 细 胞 培 养 板 并 分 为对 照 组 、L P S 处 理 组 （100ng/m l)、H M G B 1 处理组 （100ng/m l)、T G F-p l 处理(lOpg/m l)、T G F-(31 联合 H M G B 1 处理组、L PS 联合 H M G B 1 处理组 。采用 R T-qPC R 检测a -SM A 、 I 型 前 胶 原 (C o l l) 的 m R N A 的表 达 ；W estern b lot 检 测 a -S M A 、C ol I 蛋 白的 表 达 。 结 果 ： 1. 在 L P S 和 H M G B 1 刺 激 下 ，JS 1 细 胞 的 N F -kB 及 A P -1 活 性 显 著 增 高 ，M C P -1 的细 胞 表 达 和 分泌 显 著 上调 ，而 在 JS2 和 JS 3 细 胞 中 不 能 诱 导 出 上述观测指标 的显著变化 。2.T G F -131 能上调三种肝星状细胞 中纤维化相关蛋 白 C ol I 及a -SM A 的 m R N A 和蛋 白表达 ，在 JS 1 细胞中 H M G B 1 与 T G F-p i 1 复 旦 大 学硕 士 学位 论 文 20 11 共 共 同刺激能使 T G F