弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究食品科学专业论文.docxVIP

潺江天学fl!i 潺江天学fl!i I：举瞌论文 中文摘要 弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，它主要J}j 撂治疗高盘脂癌、防止动脉粥{羊硬他的生化药物，闼时由于其广谱的蚩自水船活 性，不仅在医疗上有其应用价值，而且在食品工妲、日用化学：I=业上有着广阔的 虚用前景和较离的商业价值。本文主要从菌种的选育入手，研究了弹性蛋白酶的 发酵技术和发酵工艺，阉时构建了分批发簿动力禳壁。疆究了氧载体睦溢80在 调控细胞生陡和弹性蛋白酶合成过程的作用，以及弹性蛋白酶的纯化和酶学性质 及酶键反应动力学，最后探港了弹性蛋白酶在囊类嫩化巾豹癍蠲效果和佟弼税 理。主要研究垒占论如下： (1)兢土壤中薅选豹越拣EL3掰产弹性蛋岛酶缒酶活为60U／ML，发酵24h， 经壤定该菌株为芽孢轩菌。经紫外、微波和硫酸二己醑复合诱变，突变株 EL314CFl0的产酶水平明显提蹴，为出发麓株的2．9倍。葡萄糖、酪蛋白最有刹 于菌株产生弹性蛋白酶。而麸皮和弱毛粉作为一种廉价静碳源、氮源分铡可鼠皈 代葡黼糖和酪媸白。无机氮源不利于细胞生长和弹性蛋白酶的产生。玉米提取物 作为生长因子，发现它能极人援糍生物量积累静弹性蛋白酶分泌。对获得的鬣经 单因子．葡萄糖、酪蛋白和玉米提取物进行了最适浓度正交实验，发现三个因子 对产瓣影睫熬位先颞露是：醛蛋妻l羲萄璇玉米掇取豹，三因子熬优位瘩平缀含 为4％葡萄糖、2％酪碱白和0．5％的玉米提取物。装液量影响弹性龋白酶的产生 反应出溶氧对细胞生＆和产物仓成的显著影响。 (2)用响应面优化方法对种子培养基进行了优化，牛肉膏和酵母寄对稀予的 生长影响尤为显著，磷氯化钠和蛋白胨对种子的影响不是很明显。 对发酵港养基遴行了系多《优亿，得NY优锯藤豹培养蕊缝成为吲L)：葡麓糖 74．0，酪蛋白11．30，玉米提取耢6．16，磷酸氢=钾2．06，硫酸镁0．34，pH7．5， 与帮分恍亿的培葬基鞫比，全毛荛纯壤莽塾能明显提离生物鬣爨积累拳l弹牲蛋是酶 的分泌；外加咒机盐和发面活性剂、大分子聚合物影响着曲体生|丈霸I弹性蛋向酶 合成，结果揭零钙离子能在一定程度上可以提高弹性蛋白酶活，但提高幅度不大； 低浓度的Tween．80能显著改善酶的分泌和细胞生酶，0．1％的SDS对细胞生敏和 弹性蛋白酶合成的影响是完全不一致的。高浓度的聚合物中只有O．1％的胶暇蛋 自虢箍著提赢细胞静生＆和舜瞧蛋自酶静积分泌，耀其它聚仑物对菇体生汝鞘酶 分泌存在一定的抑制或促进作川不明显：对两种培养基发酵生产弹性蚩白酶的发 酵避程比较可敬看出，全优化赢豹培养基无论是对纲胞生|丈还跫对弹性蛋囊酶合 成都有着明鼹的促进作J=l；I。 X 浙江大学博士学位论文(3)采用部分因子设计和中心组合设计对培养条件进行了筛选和优化，影响 浙江大学博士学位论文 (3)采用部分因子设计和中心组合设计对培养条件进行了筛选和优化，影响 细胞生长和弹性蛋白酶产生的主要因子是培养时间和摇床转速，两个因子对弹性 蛋白酶合成和细胞生氏的影响是不一致的，并获得了摇瓶发酵下较优的发酵条件 为：220r／min，25h，此时模型预测的最大响应值为434 U／ml。探讨不同培养温 度下细胞生长、底物消耗和产物合成发现，37。C下培养更有利于弹性蛋白酶合成， 35℃下细胞的比生长速率要明显高于37℃ 添加弹性蛋白能明显提高生物量的积累，但对产物合成提高不明显。同时对 不同添加时间进行了研究．发现所试验的两种时间下，弹性蛋白对弹性蛋白酶合 成和细胞生艮的调控效果是完全不同。 细胞生长过程中存在比较明显的波动现象。首先分析了玉米提取物对生K的 影响，玉米提取物是细胞生长和弹性蛋白酶合成的必需因子，无论添加与否，菌 体生长过程中都山现了比较明显的波动：摇瓶发酵和罐发酵的数据相结合探讨了 菌体生长波动现象的原因。实验结果显示无论是采用摇瓶还是5-L罐作为发酵体 系，细胞生长波动的本质并没有改变。SDS—PAGE分析了不同发酵条件和发酵方 法下胞外蛋白质的变化，从I乜泳的蛋白质条带数量上似乎并不能很好解释细胞生 跃波动的原因。 (4)研究了芽孢杆菌EL314CFIO的分批发酵工艺和发酵动力学，芽孢杆菌 EL314CFIO生产弹性蛋白酶的发酵类型可能属于生长部分关联型。4％的葡萄糖 浓度更有利于底物代谢，菌体生长速度要快，但最大生物量和弹性蛋白酶分泌水 平没有7．4％的高，因此可以考虑在发酵过程中采取流加碳源来解除过高葡萄糖 浓度对生k比速率抑制。 一定范围内提高搅拌转速il；Ol快底物的转化和菌体的生成，有利于弹性蛋白 酶的分泌．尤其是前期的通气鼙对发酵影响尤为显著。发酵中的溶解氧是指导发 酵过程的一个非常重要参数，可以将它作为发酵放大的依据。 用Logistic方程、Leudeking-Piret方程和Le