产溶菌酶菌株的筛选和鉴定以及溶菌酶基因的克隆和表达微生物学专业论文.docxVIP

山东大学硕士学位论文摘 山东大学硕士学位论文 摘 要 N．乙酰胞壁质酶可以选择性的水解细菌细胞壁肽聚糖结构中N．乙酰葡萄糖 胺和N-乙酰胞壁酸之间的p．1，4糖苷键。来源于微生物的溶菌酶除了具有D．1，4 N- 乙酰胞壁质酶活力外，还具有p．1，4-N，6．O．二乙酰胞壁质酶活力，能够水解鸡卵 清溶菌酶等其它类型的溶菌酶无法水解的氧乙酰化的细胞壁，具有更为广泛的溶 菌谱和潜在的应用价值。 本研究应用双层平板从土壤中筛选得到四株能溶解金黄色葡萄球菌细胞壁 的放线菌，通过16S rDNA鉴定：三株为链霉菌，分别是Streptomyces exfoliatus、 Streptomyces graminearus以及Streptomyces koyangensis，另一株为Kribbella sp．。 由于不同来源的溶菌酶具有不同的生理生化性质，其实际应用价值也有所差异， 本论文拟从四株菌中克隆N，O．二乙酰胞壁质酶基因并进行原核表达以便获得具 有医药应用价值的溶菌酶。 利用一系列胞壁质酶同源序列进行Clustalw比对，在保守区设计CODEHOP 引物，采用温度梯度PCR程序，通过两轮PCR反应扩增胞壁质酶保守区，所得 产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并连接至载体pMDl8．T，转化大肠杆菌 DH5a，对转化子进行筛选并进行测序分析。结果表明，克隆获得序列与在线设 计引物时所选的序列的保守区同源性不是很高，可能有潜在的应用价值。 根据CODEHOP扩增得到的基因片段设计嵌套引物，应用TAIL．PCR技术 扩增溶菌酶基因保守区的5’端和3’端的序列，拼接得到溶菌酶基因的全长序列。 分析核苷酸序列所对应的氨基酸序列，获得了该酶的一些特性，如等电点、分子 量等。 设计引物扩增某一种筛选菌种溶菌酶成熟肽编码区(不含信号肽序列)，在引 物的3’端和5’端分别引入NcoI和XhoI位点。将扩增得到的某一株菌的溶菌酶 成熟肽编码区连入表达载体pET-26b(+)，获得重组表达质粒pET-26b．x，重组质 粒转化表达宿主菌E coli 8L21(DE3)pLysS，筛选重组E coli BL21(DE3)pLysS ．pET-26b．x工程菌株，并对重组工程菌株经IPTG进行了诱导表达。 关键词：溶菌酶 CODEHOP 1’AIL．PCR I 山东大学硕士学位论文Abstl．act 山东大学硕士学位论文 Abstl．act N-acetylmuramidase Call hydrolyze the 3-1，4 glycosidic bond between the N-acetylglucosamine and N—acetylmuramic acid of the peptidoglycan of bacterial cell wall．The lysozymes origining from microorganisms have both 3-1，4-N-acetylmuramidase and 3-1，4-N，6-O-diacetylmuramidase activities．They have wider lysis spectrums and potential application values． Actinomycetales possessing high lytic activities were isolated from soils by the double layer plate containing intact ceils of Staphylococcus aureus．The strains were identified by 1 6S ribosome DNA．Three of them were Streptomyce， with the identity of Streptomyces exfoliates,Streptomyces graminearus and Streptomyces koyangensis，respectively．The other was Kribbella sp．Because different characters and different applications can be obtained from lysozymes with different origin，the genes of N，O—diacetylmuramidase were cloned and expressed in E．coli in order to obtain lysozymes with good application characters