哺乳动物粪便dna提取技术研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要哺乳动物粪便DNA提取技术研究 摘要 哺乳动物粪便DNA提取技术研究 硕士研究生赵健元 导师李进华教授 (安徽大学生命科学学院，安徽省生态工程与生物技术重点实验室， 合肥，230039) 摘 要 以粪便为材料提取动物DNA进行保护遗传学和分子生态学研究的关键是能 否提取到高质量的粪便DNA。自粪便DNA分析技术兴起后，国内外在这方面做 出了巨大的成就，发展了多种粪便DNA提取方法，充分证实了粪便DNA分析 的可行性。但仍存在以下问题：①各种提取方法通用性不好。在许多实验中存在 扩增成功率在物种和个体之间的差异。这一直是阻碍粪便DNA提取技术推广的 主要障碍。虽然专用粪便DNA提取试剂盒有着较好的通用性，但昂贵的价格限 制了该试剂盒的广泛应用，因此构建一套效果好、通用性好、性价比高的粪便 DNA提取方法，可以大大推进粪便DNA技术的推广。②对陈旧粪便DNA提取 的研究还是空白。本文所指的陈旧粪便是保存超过2年以上的粪便样品。从陈旧 粪便中提取DNA对于充分利用迁出或死亡动物的遗传信息，扩大分子粪便学技 术的应用范围具有十分重要的作用。⑨对粪便最佳保存方法的摸索。保存方法合 适与否对粪便DNA质量影响很大，有许多学者对各种保存方法的保存效果进行 了比较研究，但结果并不一致甚至相互抵触，这种矛盾影响了研究者对保存方法 的选择。间接地阻碍了粪便DNA技术的发展。④未考虑到与DNA提取相关环 节对结果的影响。由于粪便材料的特殊性，它的提取结果受到多重因素的影响， 如样品的采集、保存等等，忽视其中任何一个环节，都会给试验结果带来不利影 响甚至导致试验失败。 本文以l 1种哺乳动物粪便为材料，分别构建了2种新的提取方法解决了问 题①和②；以粪便DNA提取产物的浓度和纯度为指标，用正交分析对问题③和 哺乳动物粪便DNA提取技术研究④进行了分析，主要结果如下： 哺乳动物粪便DNA提取技术研究 ④进行了分析，主要结果如下： 1、本论文中构建的改进型CTAB提取方法广泛适用于各食性哺乳动物粪便 DNA提取，成功率高，一般不需重复提取。我们总计对11种动物粪便进行了 DNA提取验证，仅一次提取即得到高质量的模板DNA，对PCR产物的测序结 果也证实了方法的可靠性和通用性。虽然德国QIAGEN公司的粪便DNA提取专 用试剂盒QIAamp DNA Stool Kit也有着较好的通用性，但其昂贵的价格(50元／ 次)使其在大量分析样品时受到很大的限制。与之相比，本方法成本低廉，每提 取一个样品的成本低于3元，用实验室常用试剂即可完成粪便DNA提取，同时 产物纯度高于专用试剂盒。即拥有超过专业试剂盒提取效果，又尽可能的降低了 实验成本，真正实现了实验室通用性，有利于粪便DNA技术的迅速推广。 2、在对陈旧粪便DNA提取研究中，通过多管收集一预处理一有机溶剂抽 提的方法，从无水乙醇常温保存3～4．5年的陈旧粪便中提取到DNA并成功的进 行了PCR扩增和测序，实验效果大大优于其他方法。它证明了陈旧粪便DNA提 取及应用的可行性，解决了因动物的迁出或死亡而无法再获得这些动物的分子遗 传信息的困难，拓宽了粪便DNA分析技术的应用范围。 3、通过正交实验对粪便DNA的纯度和浓度分别进行分析，得出以下结论： 保存方法、样品与保存物质比例和保存温度三个因素对粪便DNA提取产物的浓 度有显著影响，但对产物的纯度影响不大：保存时间并非影响粪便DNA质量的 主要因素，因此若保存策略(前三个因素)正确，粪便样品应可以有效保存很长 时间。本实验得出的最佳保存策略为：用8倍于粪便样品体积(1mg粪便样品换 算为l rtl保存液)的DETs浸泡样品并置于一70。C保存。 4、取样方法在粪便DNA提取中非常重要，它对粪便DNA产物浓度和纯度 均有显著影响。在取样方法合适的情况下，提取方法将决定产物的纯度，而暴露 时间和预处理影响产物浓度。最佳的提取流程为：尽量减少粪便在野外暴露时间、 DETs冷冻保存、采样外部取样、PBS预处理、改进型CTAB法提取粪便DNA， 而粪便在野外暴露的时间则应越短越好。 关键词：粪便DNA；通用性方法；陈旧粪便；粪便保存；PCR扩增 Il AbstractResearch Abstract Research on DNA extracting technology from Mammalian Faeces Master candidate Zhao Jianyuan Academic advisor (School of Life Science，Anhui University,Anhui Key Laboratory of Ecological Engineering and Biotechnology,Hefei，230039，China) Ab