番茄花叶病毒tomv和黄瓜花叶病毒cmv单克隆抗体制备及tomv在烟草上致病分子机理研究植物病理学专业论文.docxVIP

中文摘要番茄花叶病毒(ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员。由 中文摘要 番茄花叶病毒(ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员。由 于ToMV与烟草花叶病毒(TMV)具有很近的血清学关系，基于多抗血清的检测 方法较难区分二者。利用ToMV提纯病毒作为免疫原，通过杂交瘤技术获得4株 ToMV的单克隆抗体，其中2株为ToMV特异性单抗，2株能同时检测ToMV和 TMV。4株单抗腹水ELISA效价在l：32000．I：1024000之间。Western印迹分析 表明，只有2株单抗与ToMV 17．6 kDa的外壳蛋白亚基有特异反应，而另2株无 反应，推测它们是针对构象决定簇的抗体。建立了三抗体夹心ELIsA(TAs．ELISA) 检测ToMV和TMV的方法，结果表明4株单克隆抗体检测病汁液的稀释度均能 达到1：2000倍以上。以制备的单抗和建立的TAS-ELISA方法对杭州市郊和云南 部分地区的烟草、辣椒、番茄等田间发病样品进行检测，结果发现田间样品以TMV 侵染为主。 ToMV和TMV亲缘关系很近，但二者在含Ⅳ基因烟草上所产生的枯斑大小 有显著差异。为确定TMV和ToMV在含有Ⅳ基因烟草上症状差异的决定因子， 比较了TMV、ToMV及用ToMV运动蛋白(MP)基因精确置换TMvMP基因后 获得的重组病毒T／OMP在不同寄主上的症状差异，发现T／OMP在含Ⅳ基因烟草 上产生的枯斑大小与ToMV相似。系统分析比较了TMV、ToMV和T／OMP外壳 蛋白(CP)和MP在植物体内的积累水平，发现3种病毒的CP和MP在测定的 时间内没有明显的差异。Northern印迹分析表明TMV和T／OMP在原生质体中的 复制水平也没有差异。同时，测定了TMV、ToMV和T／OMP接种后烟草体内防 御相关酶(PAL、POD和PPO)的活性变化，T／OMP和1wⅣ所诱导酶活性水平 变化趋势基本一致，而与ToMV有所差异。以上结果表明ToMV和TMV在含Ⅳ 基因烟草上的症状差异可能是由MP基因的功能差异决定的。 黄瓜花叶病毒(CMV)是世界范围内广泛分布的最具经济重要性的植物病毒 之一。CMV具有许多株系或分离物，根据不同的鉴定方法和分类系统，不同的分 离物主要被划分为两个亚组。以CMV亚组1分离物cMV_RB和cMv亚组11分离物 CMV-Z分别免疫BAL B／C小鼠，通过杂交瘤技术共获得9株稳定分泌单克隆抗体的 细胞株。间接ELISA方法测定表明9株单抗的腹水效价在1：32000．512000之间。以 TAS—ELISA方法检测单抗的特异性，结果发现6株单抗能特异地与CMV亚组I或 亚组11分离物发生反应；2株单抗既能与亚组I也能与亚组II的分离物反应，l株 亚组11分离物发生反应；2株单抗既能与亚组I也能与亚组II的分离物反应，l株 单抗只能与提纯病毒反应，而不能与粗汁液中的病毒反应。 利用其中的8株CMV革抗建立了快速区分CMV不同亚组分离物的TAS—ELtSA 检测体系。与间接ELISA方法相比，TAS．ELISA在检测亚组1分离物时二者没有 显著的差异，但对于亚组11分离物，TAS—ELISA的检测效果要优于间接ELISA。 利用TAS—ELISA方法测定了来自不同地区的197份田间样品，结果发现130份样品 为CMV，其中亚组1分离物为121份，占93．1％，而亚组11分离物为9份，占6．9％。 还建立了区分CMV不同亚组分离物的免疫捕获反转录PCR(IC—RT-PCR)检测体 系，并对TAS-ELISA反应中为阳性反应的CMV分离物进行了检测，结果表明 TAS-ELISA检测为CMV亚组I的样品仅能用亚组I特异性引物扩增出约500bp的 条带，而TAS—ELISA检测为亚组II的样品也只能用亚组II特异性引物扩增出约 600bp的条带。对其中的10个CMV分离物的IC．RT-PCR产物进行克隆和序列测定， 序列分析表明TAS．ELISA、IC．RT．PCR$fl序列测定对CMV亚组的划分是一致的。 TAS—ELISA和IC-RT-PCR快速区分CMV亚组I和亚组II体系的建立，为研究CMV 的变异进化提供了简便的方法，对了解黄瓜花叶病毒不同亚组分离物在我国的发 生分布与流行情况具有重要意义。 关键词：番茄花叶病毒烟草花叶病毒黄瓜花叶病毒单克隆抗体运动蛋白 亚组 TAS-ELISA IC．RT-PCR SummaryTomato Summary Tomato mosaic virus(ToMV)is one important member of the genus Tobamovirus． It has very closely serological relationship with T