鼻咽癌干细胞的初步研究分子病理学专业论文.docxVIP

博士学位论文摘 博士学位论文 摘 要 2002年， A1．H面j发现人乳腺癌组织中，肿瘤细胞存在不同表型，只有一‘ 小群表型为ESA+CD44+CD24。的细胞亚群，能在裸鼠体内形成移植瘤，第一次证 实了实体瘤干细胞的存在。此后，人脑胶质瘤干细胞、前列腺癌干细胞相继发 现。肿瘤干细胞的存在，改变了我们对肿瘤的认识。肿瘤组织中的肿瘤细胞存 在功能上的异质性，只有一小群肿瘤干细胞能形成肿瘤，大部分细胞为非肿瘤 干细胞；肿瘤干细胞生成肿瘤时，分裂产生大量的非肿瘤干细胞，重建肿瘤组 织的异质性。肿瘤干细胞是肿瘤转移和复发的根源。肿瘤干细胞可能来源与_i_F 常组织干细胞的突变。分离和鉴定肿瘤干细胞成为肿痛研究的热点。 与EB病毒感染相关的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高发于我 国南方及东南亚地区的鼻咽部低分化鳞癌，虽然鼻咽癌的研究有了极大的进展， 其5年生存率仍徘徊于50．60％，并未得到根本性的改善。导致鼻咽癌治疗失败 的主要原因是远处转移和局部复发。鼻咽癌是否存在肿瘤干细胞，尚无文献报 道，本实验将对此进行探讨。 目前肿瘤干细胞的研究多借鉴于正常干细胞的标志物。而正常鼻咽上皮干 细胞研究不多、其标志物不清楚，直接分离鼻酮癌干细胞存在难度，只能从干 细胞功能特性着手。造血干细胞的研究发现，干细胞能将荧光染料Hoechst 33342 泵出细胞外，在流式细胞仪中显示为小群侧群(side population，SP)细胞。研究 表明，侧群细胞的大部分细胞为造血干细胞，而且，Hoechst染料的泵出是通过 ABC转运蛋白ABCG的作用产生。由于在肌肉、骨骼、胰腺等多种组织中都发 现SP细胞的存在，并具有干细胞的特性，因此，引起SP表征的ABCG2蛋白被 认为是干细胞的通用标志物。我们对鼻咽癌细胞株5．8F和6-10B细胞，进行流 式细胞仪检测，显示NPC中ABCG2+细胞的含量为l一2％，与文献报道的实体 瘤细胞中SP细胞为1％一20％相似。为此，我们拟通过分离鼻咽癌细胞株中的 ABCG2+细胞，检测其在裸鼠体内成瘤能力，探讨鼻啊癌细胞株中ABCG2+细胞 的肿瘤干细胞特征。 第一章NPC细胞株中ABCG2+与ABCG2细胞的分选、鉴定及其成瘤能力 的比较 1．NPC细胞株中ABCG2+与ABCG2细胞的分选和鉴定 摘要细胞分选技术，国外多用流式细胞仪(FACS)，国内绝大多数流式细胞仪欠 摘要 细胞分选技术，国外多用流式细胞仪(FACS)，国内绝大多数流式细胞仪欠 先进，分选低含量的细胞时，分选时问长，降低细胞的活性、难以保证无菌， 影响以后的裸鼠体内成瘤实验。因此，我们选用免疫磁珠细胞分选器(MAcs) 分选NPC细胞株中的ABCG2+细胞。用PE．ABCG2单克隆抗体标记未分离的 NPC细胞株细胞，免疫磁珠细胞分选器分选PE．ABCG2+细胞，每lxl0 7个NPC 细胞可分离获得ABCG2+细胞3x104个，阳性细胞的回收率为30％。流式细胞仪 显示分离的ABC62+细胞的荧光值较ABCG2细胞的荧光值高，ABCG2+细胞的荧 光峰值较ABCG2细胞的荧光峰值明显右移。共聚焦荧光显微镜检测分选的 ABCG2+细胞与ABCG2一细胞，ABCG2+细胞膜因被PE．ABCG2抗体标记，呈PE 红色荧光，而ABCG2细胞不显色。Leica Qwin软件分析两组细胞的PE荧光强 度值有显著差异(pO．001)。分离的ABCG2+细胞中，呈PE染色的细胞占99％， 提示ABCG2+细胞占99％，分离纯度高。并且分离的ABCG2+细胞Hoechst33342 不染色或弱染，ABCG2’细胞呈Hoechst强染色，提示ABC62+细胞中染料泵出功 能良好。实时定量PCR检测分离的ABCG2+细胞与ABCG2细胞中ABCG2mRNA 的含量，证实ABCG2+细胞中ABCGzmRNA量较ABCG2细胞的高6—9倍，说 明磁珠分选ABC02+细胞可靠。 2．NPC细胞株中ABCG2+与ABCG2细胞在裸鼠体内成瘤性的比较 鉴定肿瘤干细胞必需证明它是唯一能生成肿瘤的细胞，裸鼠体内成瘤实验 是目前检测肿瘤干细胞的最重要指标。我们对5．8F和6-10B中分离的ABC62+ 细胞进行了裸鼠体内的成瘤能力的观察。首先，以lxl02、lxl03、lxl04、lxl0’、 lxl06的5_8F及6-10B细胞裸鼠皮下注射，只有细胞数lxl0’以上牙1能生成移 植瘤，lxl04以下的细胞数不能成瘤。因此，梅5—8F和6—10B的ABCG2+细胞 与ABCG2细胞分别以每位点2x103接种于裸鼠皮下，观察17．18周结果显示： ABCG2+组二周后开始成瘤，成瘤率为6／20；ABCG2组未见成瘤，成瘤率为0／20； 6．10B细胞