镉诱发肝细胞毒性及其胞内钙信号失调相互关系和硒的保护作用研究动物学专业论文.docxVIP

王莎莎：镉诱发肝细胞毒性及其胞内钙信号失调相互关系和硒的保护作用研究 王莎莎：镉诱发肝细胞毒性及其胞内钙信号失调相互关系和硒的保护作用研究 1 摘要 本文通过原代培养新生乳鼠肝细胞模型，运用细胞培养、荧光分光光度计、 激光共聚焦显微镜和生化分析等生物学技术，系统研究了镉负荷诱发肝细胞损伤 以及肝细胞存活性、胞内MDA含量、Ca2+．M92+_ATPase和Na+．K+-ATPase活性 以及胞内Ca”。含量的变化，细胞培养上清液中LDH及AST的活性、白蛋白及 ca2+含量变化，较为深入地探讨了镉导致的肝细胞胞内Ca”。稳态失衡的可能机 制：同时，还观察了硒干预镉诱发鼠肝细胞存活及其MDA含量和培养液中LDH 活性的变化以及硒对镉暴露肝细胞内ca”稳态变化的影响。结果如下： 1新生乳鼠肝细胞原代培养方法的建立 无菌分离新生乳鼠肝脏组织，采用胶原蛋白酶消化法分离肝细胞并使用无血 清培养液HepatoZYME．SFM对其进行体外培养，通过形态学及台盼蓝染色法鉴定， 分离的肝细胞细胞完整，呈球形或椭球形，存活率在90％以上。说明该方法是比 较理想的肝细胞培养法，为科学研究提供了细胞模型平台。 2镉诱发肝细胞毒性及其胞内游离ca2+变化研究 原代培养乳鼠肝细胞，分为三个镉处理组和正常对照组，分别加入5、10、 25 laM CdCl2染毒以及等量D．hank’S溶液。结果显示：实验后12 h，CdCl2导致 肝细胞存活剂量依赖性下降；培养上清液LDH和AST的活力升高或显著升高， 并且白蛋白含量大大降低。在CdCl2暴露12 h后，细胞内MDA生成量增加处于 较高水平，培养上清液Ca2+含量显著下降。进一步观察显示，在CdCl2暴露12 h 和24 h后，肝细胞[Ca”】。显著升高；胞内Ca”．M92+_ATP酶及Na+一K+一ATP酶活 力12 h与对照组无明显差异，至24 h下降或明显下降。提示：CdCl2通过诱导肝 细胞脂质过氧化和损伤，引发细胞存活下降和功能障碍而导致强烈毒性；镉暴露 引发肝细胞[ca2+]。异常增加可能是细胞损伤发展的重要机制，部分【ca2+]i升高 与胞外Ca”的进入有密切关系。 3镉诱发肝细胞胞内游离ca2+堆积的机制探讨 原代培养乳鼠肝细胞，用Fluo一3／AM对生长良好的原代培养肝细胞闭光孵 育，然后清洗并重悬肝细胞于有钙HBSS或无钙HBSS中，同时设计加或不加 2-APB抑制剂(100 gM)的情况，用激光共聚焦显微镜观察CdCl2(10 gM)急 性暴露引起的胞内钙离子荧光强度变化。结果显示：在仅有钙的HBSS中，CdCl2 诱导肝细胞[Ca2+]i明显上升，包括开始的缓慢上升期和随后的持续升高期；在有 钙的HBSS+2一APB中，CdCl2仅引起一个无开始上升期的缓缓升高；在无钙的 摘要 摘要 2 HBSS中，CdCl2只诱导肝细胞[ca2+]．出现开始的缓慢上升而无随后的持续升高 期；在无钙的HBSS+2．APB中，CdCl2不能引起[Ca”]i升高。提示：镉引起的胞 内钙离子堆积来源于胞内钙库释放及胞外钙离子内流。 4硒对镉诱发肝细胞毒性和胞内ca2+变化的保护作用研究 原代培养新生鼠肝细胞，分为正常对照组、4个5、25、100和250 uM CdCl2 组、2个10和20 uM Na2Se03组和8个用10和20 pM Na2Se03分别与5、25、 100和250 laM CdCl2联合作用组。实验后第12 h检测肝细胞存活及其MDA含 量和培养液中LDH活性，激光共聚焦显微镜分析肝细胞内游离Ca”水平 ([Ca2+1．)。结果显示：镉暴露肝细胞存活随镉浓度增加明显下降，硒处理组与 对照组差异不明显；硒提高或明显提高镉暴露肝细胞存活。肝细胞培养上清液 LDH活性随镉浓度增加而逐渐升高，且100和250 uM CdCl2组显著高于对照组， 而硒处理组未见明显变化；给予硒的25、100和250 laM CdCl2暴露组LDH活性 下降或明显下降。不同浓度镉均诱发肝细胞MDA含量显著升高，而硒处理组未 见类似表现：10和20 uM NazSe03抑制或显著地降低25、100和250 p．M CdCl2 诱发的MDA的生成。镉暴露肝细胞[ca2+]i荧光强度明显高于对照组，且随镉浓 度的增加而上升，而给予硒的肝细胞[ca2+]i荧光强度未见升高，与对照组相近： 加入硒的镉暴露肝细胞fca2+1。均比各对应浓度的镉处理组有较大幅度地下降，其 中给予硒的25 pM CdCl2暴露肝细胞组差异显著，且接近对照组的水平。提示： 镉诱发肝细胞毒性和损伤以及肝细胞[ca”]．升高；硒可能通过干预肝损伤细胞脂 质过氧化反应，改善和保护肝细胞[ca2+]．稳态而减轻镉诱发的细胞毒性和损伤过 程。 关键词