薄荷醇的皮肤毒性作用及其机制研究药理学专业论文.docxVIP

摘要目的： 摘要 目的： 观察薄荷醇的皮肤刺激性和致敏性；通过体外角质形成细胞(KC)培养法测 定不同浓度薄荷醇对角质形成细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率的影响，并通过电 镜扫描了解不同浓度薄荷醇作用下细胞形态结构的变化．研究薄荷醇对角质形成 细胞的毒性反应；采用流式细胞仪检测不同浓度薄荷醇对角质形成细胞细胞内 Ca2+浓度的影响来推测其发生机制。依据上述实验结果对溥荷醇皮肤安全性进行 评价。 方法： I 薄荷醇皮肤刺激性试验 1．1急性皮肤刺激性试验 家兔随机分为完整皮肤组和破损皮肤组，实验开始前24 h脱毛荠用消毒的针 头在家兔背部皮肤作划痕致渗血，制作破损皮肤模型。采用同体左右侧自身对比 法，在家兔背部皮肤上均匀涂抹薄荷醇乙醇溶液，并于去除药物后1h、24h、48h、 72h进行观察红斑和红肿等情况，试验结束后耿各组皮肤进行HE染色观察皮肤结 构改变。 1．2多次给药皮肤刺激性试验 实验方法同急性皮肤刺激性试验。每天给药1次，连续给药7天，每天观察 给药部位红斑、水肿情况。并于给药结束后lh、24h、48h、72h进行连续观察， 了解皮肤变化情况。试验结束后取各组皮肤进行HE染色观察受试部位皮肤结构 变化。 2 薄荷醇皮肤过敏试验 选取健康豚鼠分组，在其背部皮肤脊柱两侧选取面积为3 x 3cm2的皮肤，剃 毛。于1d、7d、14d重复接触薄荷醇乙醇溶液，重复接触后14d进行激发接触， 在激发接触后6h、24h、48h、72h后观察皮肤过敏反应情况。 3 薄荷醇对人角质形成细胞的影响 3．1 3．1 LDH释放率测定 将人角质形成细胞以2．0X 10；／ml接种于预铺多聚赖氨酸的24孔板，继续 培养4d后，加入薄荷醇使终浓度呈系列浓度，其中用0．1％二甲基亚砜(D～iSO) 为溶剂对照，新鲜DMEM完全培养基作为空白对照。薄荷醇作用24h后按说明书进 行操作，检测细胞内LDH释放率。 3．2薄荷醇对角质形成细胞形态的影响 取不同浓度薄荷醇作用于Kc细胞，24h后收集细胞，细胞沉淀，离心，弃 上清夜，各组加预冷的体积分数为2．5％戊二醛4ml固定2h后，磷酸盐缓冲液 漂沈3次，梯度酒精依次脱水后制备扫描电镜样本。扫描电镜观察角质形成细胞 表面形态的改变。 3．3不同浓度薄荷醇对角质形成细胞内Ca”浓度的影响 利用流式细胞仪(FcM)结合Fiuo一3／AM染色技术，半定量检测不同浓度薄 荷醇对角质形成细胞内ca“浓度的影响。 结果： 1． 薄荷醇对家兔皮肤无急性皮肤刺激性，病理检查显示不同浓度薄荷醇与溶剂 对照组的家兔皮肤解剖结构比较无明显改变。在薄荷醇多次给药皮肤刺激性中， 家兔皮肤无明显红斑、水肿，但有诸如鳞屑出现、活动频繁、屈身、尖叫、逃逸 等现象；病理检查结果显示从2％浓度组开始出现皮肤结构不同程度的改变。薄 荷醇对豚鼠皮肤无致敏性。 2． 在不同浓度薄荷醇作用下，角质形成细胞的LDH释放率除浓度为950u mol／L 时，余所有系列浓度薄荷醇作用的Kc细胞LDH释放率均≤6％，450 1．1 mol／L～1200 u mol／L组与溶剂对照组存在显著性差异(PO．05)，1400u mol／L和1600¨ mol／L组与溶剂对照组比较，差异无统计学意义(尸0．05)。在浓度为950 u mol／L 时，其LDH释放率突然增高，为(33．31±8．62)％。通过电镜扫描发现，除浓 度为950 u mol／L组，角质形成细胞表面形态发生凹陷、变形外，其余各组均未 发生变化，月．组问没有明显的差异。 3． 与溶剂对照组相比较，除450u mol／L浓度组外，其余各组不同浓度薄荷醇 作用的角质形成细胞内荧光强度发生右移，且组间存在显著性差异(PO．05)。 而450“mol／L浓度组对细胞内Ca2+浓度影响不明现可能是由于在陔浓度薄荷醇 而450“mol／L浓度组对细胞内Ca2+浓度影响不明现可能是由于在陔浓度薄荷醇 未达到激活Ca”通道所需量。结果提示薄荷醇对角质形成细胞内Ca”浓度有一定 的影响。 结论： 1． 薄荷醇对家兔皮肤无急性刺激性。在临床常用浓度(1％)下，薄荷醇多次 给药对家兔皮肤没有刺激性；但在2％浓度以上的薄荷醇在多次给药后会引起家 兔皮肤结构不同程度的改变。薄荷醇对豚鼠皮肤无致敏性。 2． 薄荷醇在950 11 mol／L浓度时，角质形成细胞LDH释放率增加明显；同时， 电镜扫描结果显示在该浓度下角质形成细胞变形较多。而其他各组LBIt释放率较 低，未见变形的角质形成细胞。实验结果提示薄荷醇对角质形成细胞损伤程度很 低，但为什么在950 u mol／L浓度时损伤程度较高、细胞变形较多，其原因有待 于进一步研究。 3． 除450 u mol／L浓度组外，其余各组不同浓度薄荷醇均促进角质形成细胞内 c