不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验-检验医学.PDFVIP

·2 10 · 检验医学 2017 年 3 月第 32 卷第 3 期 Laboratory Medicine ，March 2017 ，Vol. 32 ，No. 3 文章编号 ：1673-8640 （2017 ）03-02 10-04 中图分类号 ：R446.1 文献标志码 ：A DOI ：10.3969/j .issn.1673-8640.2017.03.013 不对称荧光 PCR 扩增白念珠菌 ITS-2 基因单链 DNA 实验 1 2 1 1 1 1 1 王敬华 ，虞培娟 ，葛 平 ，徐 蓉，陈 蓉，刘学杰 ，王华梁 （1.上海市临床检验中心临床微生物室，上海 200126；2.苏州大学附属第二医院检验科，江苏 苏州 215004） 摘要 ：目的 比较在 限制性引物不 同稀释 比例条件下 ，不对称荧光聚合酶链反应 （PCR ）扩增 白念珠菌 ITS 5.8S rDNA与28S rDNA 间内转录间区2 （ -2 ）基 因的单链DNA （ssDNA ）的实际效果 ，探讨其体系优化方 法 。方法 以常规PCR为对照 ，将20 μmol/L 的正 向引物 （P 1 ）按照一定 比例预稀释后 ，分别与20 μmol/L 的荧 ITS 光标记反 向引物 （P2 ）组成含不 同P 1水平 的引物对 ，采用不对称荧光PCR扩增真菌 -2 ，并对PCR产物进行 电泳和测序分析 ，比较各实验组扩增ssDNA 的效果 。结果 不对称荧光PCR成功扩增 出白念珠菌ITS -2基 因的 ITS ssDNA ，随着限制性引物水平 的降低 ， -2基 因的双链DNA （dsDNA ）条带逐渐变淡 ，而ssDNA条带逐渐变 亮 ；在限制性引物稀释 比例达到1 ∶90 ～1 ∶100时 ，dsDNA条带 已经模糊不清 ，而ssDNA条带则达到最亮 。提 示在此扩增体系条件下 ，ssDNA拷贝数最多 ，为不对称荧光PCR扩增 白念珠菌ITS -2基 因ssDNA 的最佳扩增条 件 。PCR产物测序也表 明，dsDNA上方 的条带为ITS-2基 因的ssDNA 。 结论 通过优化限制性引物水平 ，不对 称荧光PCR可以高效地扩增 白念珠菌ITS-2基 因的ssDNA 。 ITS 关键词 ：不对称荧光聚合酶链反应 ；白念珠菌 ； -2基 因；单链DNA Asymmetric fluorescence-PCR for the amplification of Candida albicans ITS-2 single-stranded DNA WAN G Jinghua1 2 1 1 1 1 1 ，YU Peij uan ，GE Ping ，X U Rong ，CHEN Rong ，LI U X uej ie ，WAN G Hualiang . （1. Dep artment of Clinical M icrobiology Laboratory ，