tpa基因对黄瓜的遗传转化及其在不同植物中的表达效率分析和密码子改造植物学专业论文.docxVIP

揍 揍 簧 摘要 组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator．t-PA)是一种高教特异的溶 赢栓药物，拔广泛熄应用于搬管栓塞投疾病的浚疗。耳靛t-PA已经在大脑拇蓝生物体中成 功表这并产韭纯，穗生产藏率昂贵。瘤子植褥表运系统舆有生产成本较低、表达产物安全 性高、便于大规模生产和储运等特点，因此以转基因植物为生物魇应器生产t-PA目前已成 必聚究热杰。毽撞铹表达系统存在癸瀑基霆表达囊低豹翘嚣，援夫建鼹刳了转基爨攘兹在 基因工程药物生产上的应用。 本研究娃黄瓜为生物反旋器，进行t-PA的褒这。针对，}源基嚣表达量低豹蛔题，慰t-PA 纂因进行了重新设计。并将新设计的t-PA基翻转化黄瓜，获得了转基因PCR阳性植株； 闽时对马铃薯、黄瓜和草莓的密码子用法进行分析，预测了t-PA基因在3种生物体中的表 逸壤挽，逐行了适予攘勃孛袭这戆t-PA基禹爨褥子改蕊。、篷要缭论如下： } I．t-PA基因设计 (1)在萋强转录水平上 将t-PA基因置于增强予E12和CaMV 35S崩动子调控之下，构建了植物表达载体pBET 释pBEMT。增强予E12是将CaMV 355寤动子主游419硼区域重复2敬所构成静序戴， 该序列可使CaMV 35S启动子在双子叶植物中的启动效率提高70倍。 (2)在熬译隶平土 通过PCR扩增的方式在t-PA基因起始密码子处添加了植物翻译起始按有序列AACA， 掬建了毽携表达载髂略瓢’。搓魏嚣潆起始共蠢彦裂与翁镌钵串静Kozak窿列其誊耀霹静 功能，能够加速mRNA的翻译起始。 (3)魏撵蓐拳平 通过PCR扩增的方式在t-PA基因5’端瓣加了真棱分泌信号肽序列和植物翻译起始共 裙序列AACA，在3’端添搬了内质魑定位序剃KDEL，掏建了横錾表达簸体pBEMT。真 棱分泌信鸯放序列W班引导新台成的骚白质迸^内质喇黢，KDEL序列将进^内质阚腔的 胬自质锚定在内质罔内壁上，从而阻断了蛋白质进入高尔基体和量瞰胞质的过程，进而避免 了，}滚蛋巍震鹁冥澈蕤基纯黪馋，蘧长了蛋叁壤在生耱髂肉熬半寰甥。 2．黄瓜遗传转化 将上滚结果串的植物表速袭律pBET和pBEMT转傀黄瓜获释PCR黼性撞株。 (1)黄瓜子叶节横株再生建立 V11 东北农业大学理学硕士学位论文①通过对比三种外植体(子叶、子叶节、下胚轴)的分化率，得出最佳外植体类型为 东北农业大学理学硕士学位论文 ①通过对比三种外植体(子叶、子叶节、下胚轴)的分化率，得出最佳外植体类型为 子叶节； ②通过探讨PGR(NAA、6-BA)浓度和配比对不定芽分化的影响，得出最佳芽诱导 培养基为：MS+lmg／L 6-BA(pus．8)； (2)黄瓜遗传转化 ①通过探讨Km浓度对不定芽分化率的影响，确定Km筛选浓度为30mg／-L。 ②以LBA4404(pBET)对黄瓜的遗传转化，得到56棵抗性植株(抗性芽率25．O％)。 ③以LBA4404(pBEMT)对黄瓜的遗传转化．得到59棵抗性植株(抗性芽率33．5％)。 3．抗性植株的分子生物学检测 (1)PCR检测转化t-PA基因的抗性植株32株，得到12株PCR阳性植株，阳性率为37．5％。 检测转化mt-PA基因的抗性植株36株，得到18株PCR阳性植株，阳性率为50．0％。 12)Southern blot检测了3株转化mt-PA基因的植株，得到l株Southern blot阳性植株， 并且为单拷贝整台。 4．植物密码子分析和t-PA表达预测 (1) 合作编写了生物密码子分析软件CODON ANALYSE。 (2) 检索了马铃薯、黄瓜和草莓编码蛋白基因eds序列，进行密码子用法分析，获得了 3种植物密码子用法表和高表达优越密码子。 (3) 根据CBI值预测了t-PA基因在3种植物中的表达情况，结论是原始t-PA基因适合 在草莓中表达，在马铃薯和黄瓜中表达较低。因此，在t-PA基因表达的受体植物 选择上，选择草莓较好；如以马铃薯和黄瓜为受体进行t-PA基因的表达，应对该 基因进行受体植物偏爱密码子改造。 (4) 为提高t-PA基因在马铃薯和黄瓜中的表达水平，对t-PA基因cds序列进行密码子 改造，获得了分别具有马铃薯密码子使用特点和黄瓜密码子使用特点的t-PA基因 序列。]7 一 关键词：t-PA；黄瓜；遗传转化；密码子用法：密码子改造；密码子偏爱指数 VIlI ABSTRACTTissue·type ABSTRACT Tissue·type plasminogn activator(1-PA)is a kind of hi g}l efficient and specific thrombolytic medicine and iS used widely to CUre bloo