表皮葡萄球菌atcc12228株的全基因组测序病原生物学专业论文.docxVIP

复旦大学上海睢学硫碰吐研究生论文 复旦大学上海睢学硫碰吐研究生论文 中文摘要 表皮葡萄球菌ATCCl2228株的全基因组测序 _。。_。。___■-_-- 复旦大学-匕海医学院医学分子病毒学实验室 硕士研究生张悦庆 导师瞿涤研究员 摘要 I l表皮葡萄球菌是最常见的一种凝固酶阴性葡萄球菌，寄居在正常人的皮肤 和黏膜表面。在临床上，这种细菌属条件致病菌，主要在体内长期留置导管(如 中央静脉插管、腹膜透析等)和接受人工器官(如人工关节、人工晶体、人工 心脏瓣膜等)的患者中引起感染。近年的统计结果显示，其发病率已居医院内 感染的第4．5位，呈明显上升的趋势。现已知道，表皮葡萄球菌的致病性与其 能在人造高分子材料表面形成细菌生物膜密切相关，但对这种生物膜的结构和 形成的过程仍然知之甚少。对这种细菌的全基因组进行测序将有助于人类更全 面、更深入地认识其生理特点和致病机理，最终获得新的药物作用靶点和疫苗。 本课题选择的表皮葡萄球菌卢汀CCl2228株是一株弱致病株，其全基因组序列 将为今后研究其它菌株中的致病相关基因提供一个极好的参照。r 自从1995年美国的TIGR(The Institute of genomic researeh)中心采用全基因 组“鸟枪法”(Shotgun)测序策略成功地测定了世界上首个细菌(流感嗜血杆 菌)的完整基因组序列后，这种测序方法己被广泛接受，是目前细菌全基因组 测序项目中最常用的一种方法。本课题同样采用Shotgun测序策略对表皮葡萄 球菌ATCCl2228株进行全基因组测序。 Shotgun测序过程需要构建小片段(1 5-3kb)和大片段(6-50kb)两个不同 的测序文库。本课题的第一部分是测序文库的构建和质量鉴定。细菌基因组DNA 的制备采用将细菌包埋于低熔点琼脂糖凝胶后用蛋白酶K和SDS“原位裂解” 的方法。在用于构建文库之前，首先经过长时间电泳除去这些含有完整基因组 DNA的凝胶块中的天然质粒以提高文库建成后的随机性。经处理后的基因组 DNA用超声随机粉碎，选取1．5．3kb长度的片段克隆入pUCl8／SmaI／BAP载体 构建小片段文库。经HindIII和EcoRI双酶切鉴定随机挑选的18个克隆，确定 其插入片段的平均长度为2．2kb。另外，用大规模抽提质粒的方法制备了96个 质粒模板，其中6个为空载体(空载体率约为6％)，其余质粒的正方向测序结 果与NCBI核酸序列数据库作blastn比对后，发现每条序列的比对结果均不同， 说明此小片段文库的随机性良好，可用于大规模测序。大片段文库的构建方法 略有不同；经电泳处理后的基因组DNA先用Sau3AI进行不完全酶切，再选取 8-lOkb长度的片段克隆入pUCl8／BamHI／C1P载体。和鉴定小片段文库质量的方 复J 复J l大学上海医学院硕士研究生论文 中文摘要 法一样，首先随机挑选了12个克隆进行Hindlll和EeoKl的双酶切反应，确定 平均插入片段长度约为7 8kb。在随后制备的96个克隆中，有5个是空载体(空 载体率约为5％)，其余序列与核酸序列数据库比对的结果同样未发现序列的堆 积现象，说明此大片段文库也有良好的随机性，可用于大规模测序’。r 本课题的第二部分为大规模测序及全基因组序列的组装。在大规模测序过 程中，分别用小片段文库测定了434]0条序列、大片段文库测定了4150条序列， 总计序列达47560条。其中质量达到被phrap接受标准的共有45835条，占总 数的96％，序列平均长度为614bp。所有序列经phrap组装后得到100个长度超 过2kb的序列重叠群(Contig)以及6条完整的质粒序列(长度依次为4439bp、 4679bp、6585bp、8007bp、17261bp、24370bp)。位于这些Contig之间的100 个缺口序列中，66个为序列缺口(即已被克隆，但未被测序到的序列)，30个 为物理缺口(即未能克隆到的序列)，其余4个是rDNA(编码16S．23S．5S的基 因)区域的断裂。序列缺口的填补是通过在相应Contig的末端设计外延性引物， 以跨越而过的质粒为模板直接进行测序。在本部分中，共进行了三轮这种引物 设计和测序过程，填补了所有66个序列缺口。物理缺口的填补则有所不同，首 先需用PCR方法扩增出这些区域的DNA片段，然后再对PCR产物测序后进行 填补。通过与金黄色葡萄球菌Mu50株的序列比较，确定了在该株细菌上相邻 的15对Contig末端，经设计外延性引物进行PCR扩增测序，填补了这15个缺 口。另外15个物理缺口则通过四轮组合PCR并测序后得到。在填补缺口期间， 同时进行