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直肠癌组织podoplanin的表达与淋巴结转移关系的研究 　　摘要：目的：观察podoplanin在直肠癌组织淋巴管内皮细胞上的表达情况，为研究淋巴结转移提供病理形态学依据。方法：用SP免疫组化法检测实验组和对照组podoplanin的表达情况。结果：实验组的LMVD高于对照组的LMVD；同时A组中淋巴结转移组高于淋巴结未转移组，差异有统计学意义。结论：podoplanin特异表达于淋巴管内皮细胞上，可区别微淋巴管与微血管，在直肠癌组织、癌旁组织中高表达，推测直肠癌的淋巴结转移可能与淋巴管数量的增加相关。　　关键词：直肠肿瘤；podoplanin；淋巴管；微淋巴管　　中图分类号：　　文献标志码：A　　文章编号：1008--0026-04　　直肠癌是最常诊断的肿瘤之一，约60%的病例出现在发达国家和地区。美国直肠癌发病率排第3位，欧洲直肠癌发生率排第2位。直肠癌还是最常见导致死亡的癌症，无论是直肠癌发生率最高的欧洲中东部还是在发生率最低的中非，直肠癌死亡率变化不大，随着我国经济水平的提高，生活方式改善，我国直肠癌发病率也逐年升高。有关直肠癌的中podo-planin蛋白表达与淋巴结转移关系的研究，对临床医生对直肠癌患者的治疗策略有着重要意义。笔者主要通过探究免疫组化检测的podoplanin在直肠组织与癌组织及癌旁组织中的表达差异来推测淋巴结是否转移，为直肠癌的临床分期及手术方式提供理论依据。　　1 材料与方法　　 材料　　选取桂林医学院附属医院病理科的存档蜡块60例作为实验组，相应正常直肠组织蜡块10例作为对照组，每例直肠癌蜡块均包含癌中央区、癌组织和癌周组织，术前均未接受过化疗。根据病理学结果将标本分为淋巴结转移组和无淋巴结转移组。男35例，女25例；年龄35～85岁，平均岁；病理学分级按照Duke分期分为，A+B级24例，C+D级36例，所有的直肠癌标本和淋巴结标本均行常规病理检查确诊。所有的病例均资料完整。　　 仪器与试剂　　切片机，培养箱，OLYMPUS显微镜，转移器，抗podoplanin单克隆抗体，免疫组化PV-9000试剂盒和二氨基联苯胺试剂盒。　　 免疫组化染色　　①采用SP法，标本经1O%中性缓冲甲醛液固定后，常规制作石蜡包埋块并切片，切成薄片，常规脱蜡至水，枸橼酸盐高温高压法抗原修复2min。②用3%的H202浸泡。室温孵育1Omin.阻断内源性过氧化物酶。③磷酸盐缓冲液漂洗后甩干，滴加抗podoplanin抗体，之后37℃恒温箱下1h。④复温、漂洗，滴加聚合物辅助剂，室温孵育20min，辣根过氧化酶标记二抗，室温处理30min。⑤用PBS冲洗，DAB显色，复染后封片。　　 结果判定与淋巴管计数方法　　podoplanin的着色部位位于细胞膜。主要表达于由单层内皮细胞构成且管壁较薄，外周无周细胞且无平滑肌的淋巴管，其管腔内无红细胞，有的管腔内可见絮状物，用400倍视野的光镜进行形态学判定之后，Podoplanin染色阳性的微脉管皆为淋巴管。po-doplanin染色阳性标记的脉管数视为微淋巴管密度。微淋巴管计数采用Weidner计数法，每例标本先于40倍低倍镜下观察，选择最密集的区域，转换视野于400倍光镜下观察染成棕黄色的单个内皮细胞或细胞簇，并以此作为一个微淋巴管，随机计数5个视野内微淋巴管数，然后取其平均值作为LMVD，癌周淋巴管密度定义为距离直肠癌组织边缘100μm以内的周边区域内podoplanin阳性表达的微淋巴管数。　　 统计学方法　　应用统计学软件处理数据，计量资料以x±s表示，组间差异采用t检验、方差分析，以P为检验标准，差异具有统计学意义。　　2 结果　　在正常直肠组织、直肠癌组织、癌旁组织的表达　　免疫组化染色结果显示，podoplanin在正常直肠组织的各层次均可见到有阳性染色微淋巴管，以黏膜下层数量最多，且呈扩张状、壁薄、形态大小不一。podoplanin的在直肠癌组织和癌旁组织中淋巴管内皮细胞呈阳性表达。Podoplanin在正常直肠组织细胞、直肠癌细胞、血管内皮细胞呈阴性反应。　　 直肠癌组织、癌旁组织、正常直肠组织LMVD的比较　　切片镜下观察到podoplanin染色阳性的微淋巴管多位于癌旁组织及直肠癌组织的胞膜上，其数量与形态差异较大，癌周微淋巴管数量多且管腔多扩张；而癌内微淋巴管多为条索状或闭塞的狭隙状且数量少，在正常组织中podoplanin呈棕黄色的淋巴管基本没有。　　直肠组织中有淋巴结转移的LMVD高于无淋巴结转移者，癌旁组织中有淋巴结转移的LMVD也高于无淋巴结转移者，差异有统计学差异。详见表1。　　3 讨论　　 淋巴管的研究动态及结构功能　　镜下辨别淋巴管是研究肿瘤淋巴结转移机制的基础，由于形态学上小血管和