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蛋白质分离介质的选择之 ————蛋白质分离工作的特殊性 蛋白质的分离纯化有多类方法，如沉淀法（特别常用盐析法、等电点沉淀法、 有机溶剂沉淀法）、膜分离法（超滤法、透析法）、色谱法、离心分离法等。每类 方法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀法，精提就不会用沉淀法。这些 方法中，应用最广的是色谱法。 色谱法，在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊 都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中“chromatography”一词翻 译成“色谱” 。故在此我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。 在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从事分离工 作的人，拿到样品后常不知道怎么办。其实这两者的选择只要根据分离对象和每种 色谱的分离机理来考虑，就可以自行设计分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋 白质分子结构入手考虑。 与一般小分子的天然产物和合成化合物的分离纯化工作比起来，蛋白质的分离有 许多特殊性。 1.蛋白质分子的结构决定了其分离工作的方法选择。 蛋白质分子量大，都在6KD 以上，是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合成肽 链，再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成有复杂三级、四级结构的蛋 白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合得到结合蛋白，不同的结合蛋白在性 质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状，其大小因其分子量不同差异很大。 故可以用排阻色谱、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。 蛋白质与氨基酸一样，会两性离解，在不同的pH下形成正离子或负离子，蛋白 质也有等电点。在相同的pH下，不同的蛋白质表面带电情况不一样，故可以用离子 交换色谱分离蛋白质。 蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团，这些疏水侧链在水相中 会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部，形成蛋白质分子外部亲水性基团多，疏 水性基团多在蛋白质裂隙内部的情况，在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而 暴露出内部的疏水基团。在同一个介质中，不同蛋白质表面的疏水性不同，可以用 疏水相互作用色谱和反相色谱分离。 生物大分子有一个特性，某些分子或基团对它们有特异性很强的吸附作用。这种 作用只针对一种或一类目标物质。如抗体特异性吸附抗原，苯甲脒对含丝氨酸的蛋 白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理,一般的小分子是不会有这种特异性吸 附作用的。 2.要特别注意保持样品的生物活性。 蛋白质有复杂的三级、四级结构，热、光和化学品会导致其理化性质改变和生理 活性丧失，这叫失活。失活有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体， 不溶于水和溶剂，不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的 复性方法恢复其原有的生理活性。 蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色谱条件时，不仅要注意样品的质 量回收率，还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性，在分离方法、填料、 色谱条件和操作工艺上要注意。 在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色谱中，反相色谱一般容易使样品失 活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制备；其他的色谱方法， 只要条件选择合适，都可以得到高的活性回收率。 3.使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。 一般的介质都是多孔的，多孔介质的比表面有90%~95%是在孔内。分离时充分 利用孔内表面，柱容量才能大。所以要根据样品分子量选择具有合适的孔的介质。 在排阻色谱中孔的大小用排阻极限表示；其他色谱用分子量适用范围表示，实际是 其基质的排阻极限。 常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖的分子量适用范围取决于 制备时琼脂糖的浓度，大家熟悉的4B ，糖的浓度是4% ，适用6 ×104~2 ×107分子量； 6B，糖的浓度是6%，适用1×104~4 ×106分子量。葡聚糖系列的分离范围要看产品 说明书，从几千到上千万不等。 常用的硅胶系列孔径有用于小分子的6~12nm ；有用于一定分子量蛋白质的30、 50、100nm。 4.生物大分子有不同于小分子的色谱特性。 包括蛋白质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。 在梯度洗脱的色谱，如反相色谱、疏水色谱、离子交换中，强洗脱剂的浓度对保 留值（容量因子）作图有明显的突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。